Bandas en común respecto a suelo original

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1 Bandas en común respecto a suelo original
DINÁMICA DE LA ESTRUCTURA DE LA COMUNIDAD BACTERIANA DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS EN CULTIVOS DE ENRIQUECIMIENTO CON SUELOS ANTÁRTICOS CONTAMINADOS CON GASOIL (Dynamics of bacterial community structure of hydrocarbon degrading enrichment cultures with Antarctic soil contaminated with diesel oil) Kuc V(2,3), Hernández E (1,2), Vázquez S(2), Martínez-Alvarez L(1,2) , Coria S(1,2), Mac Cormack W(1,2), Ruberto L(1,2) Instituto Antártico Argentino (2) Instituto de Nanobiotec, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA (3) Universidad Nacional de Quilmes RESUMEN En suelos contaminados con hidrocarburos (HC) se desarrollan comunidades microbianas complejas, de composición diferente a la de los suelos prístinos. Estas diferencias responden a las condiciones ambientales particulares que imponen la presencia de los hidrocarburos. Luego de la aplicación de una estrategia de bioestimulación a suelos de la Base argentina Carlini (Fig. 1) contaminados con gasoil, se logró una remoción de aproximadamente el 85% de los hidrocarburos, detectándose la persistencia de algunos alcanos lineales (C11, nC12, nC13 y nC14). Para desarrollar herramientas biológicas específicas para la eliminación de estos compuestos, se realizaron cultivos de enriquecimiento de las comunidades de microorganismos de dicho suelo con los diferentes alcanos como única fuente de carbono y energía. Los cultivos mostraron distintos aspectos según el hidrocarburo utilizado (Fig. 2). Esta observación impulsó la caracterización genotípica de las comunidades bacterianas en estos cultivos de enriquecimiento, mediante DGGE. Los resultados obtenidos sugieren que la estructura de las comunidades microbianas depende del hidrocarburo utilizado como sustrato durante los cultivos de enriquecimiento. Fig 2. Cultivos de enriquecimiento a partir de suelo contaminado con gasoil utilizando diferentes hidrocarburos como fuente de carbono y energía: nC11, nC12, nC13, nC14, una mezcla 1:1:1:1 de cada uno y control sin fuente de C. OBJETIVO Caracterizar genotípicamente las comunidades bacterianas que desarrollan en cultivos con diferentes hidrocarburos como fuente de carbono y energía. Fig. 1. Base argentina Carlini, Antártida. El suelo contaminado de la zona aledaña a los tanques de combustible fue utilizado como fuente de los microorganismos para los cultivos. METODOLOGÍA Análisis bandas de DGGE Comparación de bandas mediante el coeficiente de similitud de Dice. Fuente de microorganismos Suelo contaminado de la zona aledaña a los tanques de combustible de la Base Carlini, previo tratamiento de bioestimulación que redujo la concentración de HC en aprox. 85%. Cultivos de enriquecimiento 15°C; agitación; erlenmeyers de 250 ml; 50 ml de medio salino basal y distintos HC como única fuente de carbono y energía: undecano (nC11), dodecano (nC12), tridecano (nC13), tetradecano (nC14) y una mezcla 1:1:1:1 de cada uno. Se realizaron tres repiques sucesivos de cada cultivo (cada 8 días). Se transfirieron 1000 µl a otro erlenmeyer conteniendo medio fresco. Muestras: se tomaron al inicio y fin de cada ciclo y se conservaron a -20°C. Aislamiento del ADN genómico bacteriano: Del suelo de las muestras a tiempo inicial (T0) De cultivos T1 (8 días) y T3(24 días) con kit comercial (Mobio). Amplificación por PCR de un fragmento del gen del ARNr 16S DGGE 6% poliacrilamida; gradiente desnaturalizante muestra marcadora (STD) para análisis de bandas. Digitalización y normalización de los perfiles de bandas con el programa Gelcompare II versión 6.5 T0 T1- 8 días 1000µL 1º Repique 1000µL 2º Repique 1000µL 3º Repique T2- 16 días T3- 24 días RESULTADOS Riqueza (número de bandas) Bandas en común respecto a suelo original Bandas en común T1/T3 T0 T1: 8 días T3: 24 días nC11 16 8 9 3 4 6 nC12 7 10 5 nC13 1 nC14 mezcla 2 Fig. 4. Análisis del número de bandas presentes en cada sistema a lo largo del experimento y evolución de los valores de riqueza. Fig. 3. A) Gel de DGGE con un gradiente de 40-65% de urea formamida. B) dendrograma obtenido a partir del patrón de bandas utilizando el índice de similitud de Dice. El patrón de fragmentos del suelo (T0) y de los sub-cultivos resultaron claramente diferentes entre sí, especialmente a tiempo final. Los duplicados del suelo original (T0) mostraron una similitud del 100%, evidenciando una alta reproducibilidad de la técnica aplicada. El T0 fue muy diferente a los subcultivos en medios selectivos (30% de similitud). En T1 todos los tratamientos mostraron una similitud de más del 80% entre sí, excepto C14. En T3 las diferencias entre tratamientos se incrementaron notoriamente. CONCLUSIÓN El uso de diferentes hidrocarburos como sustrato en cultivos de enriquecimiento a partir de un suelo antártico contaminado con gasoil resultó en el establecimiento de comunidades bacterianas con diferente estructura. Diferencias de un carbono en la cadena lineal de los alcanos utilizados como sustrato, determinaron comunidades microbianas con similitudes menores o iguales al 80%, incluso a los 8 días de cultivo. Los patrones de bandas a los 8 y 24 días sugieren que estas comunidades están compuestas por múltiples integrantes. La riqueza de algunas de las comunidades cambió entre sub-cultivos e incluso se incrementó en alguna de ellas entre los 8 y los 24 días de cultivo (3 repiques).