1 CROMATOGRAFÍA Cátedra de Química Orgánica

2 Objetivos Incorporar los conceptos teóricos en los que se fundamenta la cromatografía en sus distintos tipos. Ejemplificar la utilidad de las técnicas cromatográficas como método de separación y como criterio de pureza e identificación. Aplicar las técnicas de capa delgada y columna para la separación de pigmentosvegetales (adsorción) y papel para la separación de colorantes alimentarios (partición).

3 Origen A principios del siglo XX, el botánico ruso Tswett separó pigmentos vegetales pasando soluciones de estos pigmentos por una columna de vidrio empaquetada con CaCO 3. Las especies separadas aparecían como bandas de colores, lo que dio origen al nombre del método chroma = color graphé = escribir

4 CROMATOGRAFIA Sistema Cromatográfico: Fase Móvil Fase Estacionaria solutos Uno o más

5 Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración entre los componentes de la muestra, debidas a interacciones con las fases,, una estacionaria y otra móvil

6 Clasificación de las técnicas cromatográficas: 1) Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación 2) Clasificación de acuerdo al estado físico de las fases 3) Clasificación de acuerdo al lecho cromatográfico

7 Proceso físico - químico que rige la separación: Adsorción: El soluto se adsorbe en la superficie de las partículas sólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentes de hidrógeno. Partición o Reparto: El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio 1)Clasificación de acuerdo al mecanismo de separación

8 - Intercambio Iónico: Los aniones o cationes se unen a la fase estacionaria sólida por fuerzas iónicas - Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel: No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.

9 2) Clasificación de acuerdo al estado físico de las fases: Tipo de fase estacionaria Sólido: finamente dividido en un tubo de vidrio o metal líquido inmiscible con la fase móvil. Se emplean distintos procedimientos para fijar la fase estacionaria líquida. Tipo de fase móvil Gas líquido

10 Tanto el soluto como el solvente son atraídos por los sitios polares de la fase estacionaria, pero la separación es posible por las distintas fuerzas de atracción. Adsorción Fase estacionaria: sólido (sílica o alúmina)

11 Partición La separación se basa en la solubilidad relativa del soluto entre dos fases líquidas. Se utiliza gel de sílice que absorbe agua fuertemente. La fase estacionaria es el agua.

12 Coeficiente de Partición K = Cs fase estacionaria / Cs fase móvil Cs: concentración de soluto A > K, el soluto tarda más tiempo en pasar por la columna

13 Intercambio iónico La fase estacionaria (resina) tiene su superficie con carga opuesta a la del soluto que se quiere retener.

14 Exclusión por tamaño (gel permeation) La separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria es un material de tamaño de poro controlado.

15 Afinidad Sólo es retenida la molécula afín a las unidas covalentemente a la fase estacionaria.

16 Fase Estacionaria : Partición: La fase estacionaria es líquida, sobre un soporte sólido inerte. 1 - Común (Agua) 2 - Reversa o Inversa (parafina) El papel contiene un 20 % de agua retenido aunque nosotros lo notemos seco, esa es la fase estacionaria.

17 Exclusión molecular: Tierras de Diatomea Sephedex (geles) Adsorción: Silica Gel (Oxido de Silicio). Alumina (Oxido de Aluminio). Celulosa. Fluorisil (Silicato de Magnesio). Sulfato de Calcio. Fase Estacionaria :

18 Intercambio Iónico: Resinas Catiónicas Aniónicas Acido sulfónico RSO 2 - H + Acido carbóxilico Ión amonio cuaternario Grupo amina RCO 2 - H + R 3 NR + OH - R 3 NH 3 + OH - Fase Estacionaria :

19 3)Clasificación de acuerdo al lecho cromatográfico: -Cromatografía plana: en papel capa fina -Cromatografia en columna

20 Fase estacionaria Fase móvil Proceso cromatográfico Capa fina Columna Adsorción I. Iónico Esc. Molecular AdsorciónColumna Papel Capa fina Columna Partición Columna Líquida Sólida Gas Técnica cromatográfica

21 Cromatografía en Papel y Capa Fina (TLC) Sembrado: Puntiforme Banda Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

22 Cualitativa xx Identificación xx Pureza xx Ausencia Cuantitativa xxxx Preparativa

23 Desarrollo Simple Múltiple Descendente Ascendente Circular Horizontal Común Bidimensional Continuo x a - distancia recorrida por el analito. b - distancia recorrida por el frente a b

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25 Fase Móvil COOH OH NH 2 SH CHO CO COOR OCH 3 Hidrocarburos No Saturados Hidrocarburos Saturados Acidos carboxílicos Alcoholes Aminas Tioles Aldehidos Cetonas Esteres Eteres Alta Baja Polaridad Saturación de la Cámara

26 Cromatografía en capa delgada

27 Cromatografía de capa fina

28 Revelado Difiere de acuerdo al objetivo planteado Clasificación de reveladores H 2 SO 4 I 2 Lámpara ultravioleta No Destructivo Destructivo Técnica de bañado Aplicación Técnica de pulverización Revelado

29 H 2 SO 4 Lámpara ultravioleta I 2 Ftalato de anilina (azúcares) Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas) Difenilamina + U.V. 254 (Clorados) Generales Selectivo Específico Revelado

30 Estimación del área de la mancha (por medida, pesada) Determinación indirecta (raspado y valoración) Determinación directa (Densitómetro) Detector Fuente de luz Placa cromatográfica Cromatografía Cuantitativa

31 Cromatografía en Columnas Son de acero inoxidable o vidrio, tienen un diámetro de 0,5 a 6 cm y una longitud de cm a más de 1 m. Se rellenan con la fase estacionaria sólida o un soporte inerte recubierto con la fase estacionaria Una columna más larga aumenta el grado de separación Se usan con fines analíticos y preparativos

32 Elución: el soluto es lavado de la columna por agregado de solvente

33 Volumen de retención V R Volumen de la fase móvil requerido para eluir el soluto de la columna Tiempo de retención t R Tiempo requerido para para eluir el soluto de la columna. t R es característico de una sustancia. Debe ser comparado con un standard. V R = t R. V flujo Tiempo de retención t m Es el tiempo que tarda un soluto que no es retenido en pasar por la columna.

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35 Cromatografía gaseosa -Fue el primer método cromatográfico instrumental que se desarrolló comercialmente -Sólo se necesita un cilindro de gas comprimido y un regulador de presión para mantener un fluído estable

36 Cromatografía gaseosa Compuestos orgánicos volátiles Carrier: He, Ar, H 2

37 Gases Portadores La elección de la fase móvil influye en el funcionamiento de la columna y el detector. Los gases más utilizados son: H 2, He y N 2. Los tres producen una A.E.P.T. = 0.3, pero con gastos distintos, mientras que el N 2 10 cm/s, el H 2 y el He pueden utilizarse a un gasto mayor. Por lo tanto se debe mantener el el flujo del gas portador a una velocidad constante.

38 Inyección de la muestra La muestra se inyecta con un jeringa a través de un septo de goma y se vaporiza. Generalmente 0.1 a 10  L. Controlar la temperatura del horno de inyección. Para columnas tubulares se tienen que manejar con puertos de inyección más elaborados pues no pueden manejarse muestras tan grande. La inyección dividida: Sólo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a 2  L de muestra inyectada llega a la columna; el resto se elimina.

39 CROMATOGAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (H.P.L.C.) Desgasificador de solventes Abastecimiento de solvente Filtro Bomba Válvula de seguridad y purga Columna analítica Espacio térmico Lectura Amplificador Recolección o descarga Descarga Gases disueltos Jeringa o válvula para la muestra Introducción de la muestra Preco- lumna Medidor de presión

40 Fase estacionaria Todos los tipos de cromatografía pueden realizarse en el modo de alta resolución. Un soporte común es el partículas microporosas de sílice con diámetro de 5 a 10  m.

41 Solventes Los solventes utilizados deben ser muy puros. Se puede utilizar un solo solvente (elección isocrática). Se puede cambiar un solo solvente por otro luego de un tiempo apropiado. Se puede cambiar continuamente de composición del solvente (elección por gradiente).

42 Extracción Pigmentos 20 g de hojas verdes (espinaca, acelga, etc.) se cortan en finos trozos con tijera y se colocan en el mortero. Se agregan 20 mL de acetato de etilo y se maceran por 5 minutos realizando un movimiento giratorio con el pilón. La solución debe quedar de color verde intenso. Una vez pasado los 5 minutos se exprime el sólido (utilizar guantes) para extraer la mayor cantidad de pigmentos posibles. La solución obtenida se filtra por gravedad (utilizando un embudo con papel de filtro o algodón), recogiéndose en una ampolla de decantación. A la ampolla se le adicionan 10 mL de solución de cloruro de sodio al 0,1%, se extrae, se separan las fases y se reserva la fase orgánica. El extracto de color verde intenso se seca con una punta de espátula de sulfato de sodio anhidro. Finalmente se comprueba la cantidad de componentes por CCD.

43 Parte experimental

44 Parte experimental

45 Parte experimental