RNAinterference (RNAi) Gerard Sellarés Martínez Módulo 6 – Genómica y Proteómica

Antecedentes ? 1990 R. Jorgensen 1995 Guo S & Kemphues KJ 1998 Andrew Fire & Craig Mello 1990 R. Jorgensen“Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell 1998 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature. 1998 1995 Guo S, Kemphues KJ. ”par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed” .Cell

Introducción La ribointerferencia o interferencia del RNA es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero (mRNA), conducen habitualmente a la degradación de éste (Fire and Mello,1998) dsRNA siRNA (19-23 pb) shRNA miRNA

Chemistry & Biology 19, January 27, 2012

Componentes del mecanismo RNAi Nature reviews, February 11, 2012

Mecanismos de silenciamiento Amplificación de la señal  En plantas, hongos y C. elegans Se generan nuevas moléculas de siRNA (secundarias), específicas para diferentes secuencias del mismo mRNA, generando un efecto de amplificación Resistencia las infecciones virales

Mecanismos de silenciamiento Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe Estas secuencias repetitivas y los cenRNAs atraen enzimas como la Histona Metil-Transferasa (HTMasas, de las siglas en inglés) tipo H3K9 (metilan la lisina9 de la histona H3), proteínas HP1 y otros complejos que median la formación de heterocromatina. Nature 457, 413-420(22 January 2009)

Utilización en el laboratorio Silenciamiento de genes (“Knockdown") Se sintetiza dsRNA (o siRNAs/shRNAs en mamíferos) con una secuencia complementaria a la del gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético extraño, lo que activa la ruta del RNAi.

Utilización en el laboratorio Obtención de una línea de ratones transgénicos para RNAi

Aplicaciones Genómica funcional Medicina Biotegnología Terapias antivirales (Expresión génica viral en células cancerosas, HIV, Hepatitis A y B, etc) Terapias en enfermedades neurodegenerativas (Enfermedad de Hungtington). Terapia contra el Cáncer Medicina Genómica funcional C. Elegans y Drosophila como animales modelo (también Plantas). Mapeo y construcción de librerías genómicas de RNAi Biotegnología Diseño de plantas alimenticias Aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas

Ventajas Fácil de utilizar Rapidez en la obtención (algunos días) Disminuye tiempo, “coste” y aumenta la especificidad Válido en experimentos in vivo e in vitro Viable en cualquier tipo celular La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo

Inconvenientes Estabilidad Rápida eliminación Sensible a las nucleasas presentes en el plasma Vida media corta Limitaciones en el uso in vivo Administración (Deben estar protegidos) Off-target (OTEs) Reducción no intencionada de la expresión Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis dependientes Generación de respuesta inmune (respuesta vía INF, secuencias CpG, etc)

Bibliografía Burnett JC, Rossi JJ. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects. Chem Biol. 2012 Jan 27;19(1):60-71. Review Fattal E, Bochot A. Antisense oligonucleotides, aptamers and SiRNA: promises for the treatment of ocular diseases. Arch Soc Esp Oftalmol. 2006 Jan;81(1):3-4, 5-6. English, Spanish.  Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11.  Guo S, Kemphues KJ. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995 May 19;81(4):611-20.  Guo S, Kemphues KJ. A non-muscle myosin required for embryonic polarity in Caenorhabditis elegans. Nature. 1996 Aug 1;382(6590):455-8.

Bibliografía Hall IM, Noma K, Grewal SI. RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jan 7;100(1):193-8. Epub 2002 Dec 30. Hannon GJ. RNA interference. Nature. 2002 Jul 11;418(6894):244-51. Review. Kole R, Krainer AR, Altman S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 2012 Jan 20;11(2):125-40. doi: 10.1038/nrd3625. Review. Lee SK, Siefert A, Beloor J, Fahmy TM, Kumar P. Cell-specific siRNA delivery by peptides and antibodies. Methods Enzymol. 2012;502:91-122. Review.  Singh S, Narang AS, Mahato RI. Subcellular fate and off-target effects of siRNA, shRNA, and miRNA. Pharm Res. 2011 Dec;28(12):2996-3015. Epub 2011 Oct 28. Review. Sobala A, Hutvagner G. Transfer RNA-derived fragments: origins, processing, and functions. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011 Nov-Dec;2(6):853-62. doi: 10.1002/wrna.96. Epub 2011 Jun 30. Review. Wang Z, Rao DD, Senzer N, Nemunaitis J. RNA interference and cancer therapy. Pharm Res. 2011 Dec;28(12):2983-95. Epub 2011 Oct 19. Review. Zeller SJ, Kumar P. RNA-based gene therapy for the treatment and prevention of HIV: from bench to bedside. Yale J Biol Med. 2011 Sep;84(3):301-9. Review

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