CROMATOGRAFíA EN COLUMNA Licda. Carol de Santisteban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

TIPOS, SEGÚN FM C. de líquidos C. de gases C. de fluidos supercríticos

C. De líquidos Todos los tipos de fases estacionarias y móviles. Diferentes posibilidades de mecanismos de separación, según tipo de fase estacionaria. Características esenciales de solventes: índice de polaridad (reparto) fuerza eluyente (adsorción)

Mecanismos de separación C. de adsorción C. de reparto C. de afinidad C. de intercambio iónico C. de exclusión molecular

Selección Fase estacionaria de acuerdo a interacciones posibles según naturaleza del analito Van der Waals  reparto fase reversa Polar  reparto fase normal Medianamente polar  adsorción Iónico  intercambio iónico Biomoléculas: Distribución de tamaños  exclusión molecular Distribución de cargas  intercambio iónico, otras Actividad biológica  afinidad Fase móvil de acuerdo a fase estacionaria e interacciones deseadas

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

FASES ESTACIONARIAS Fase estacionaria adsorbente Carbonato de calcio, Tswett Sílica, alúmina las más utilizadas actualmente Sílica > alúmina (capacidad de carga, variedad, reacciones indeseadas) Forma, porosidad, superficie,

En sílica

Fases estacionarias comerciales

Interacciones

FASES MÓVILES Dada una FS la FM controla k’ y α Fuerza eluyente Energía de adsorción del disolvente (en la FS) por unidad de área (de FM) A mayor valor de ε0 mayor fuerza  mayor polaridad Mezcla de solventes  valores intermedios de fuerza eluyente, pero la relación no es lineal

Variación de k’ y α Variación de retención Variación de selectividad Cambio de proporciones Cambio de fuerza eluyente Variación de selectividad Cambio de solventes Conservación de fuerza eluyente Pruebas preliminares en capa fina

Fases móviles comunes

RETENCIÓN Alcanos < olefinas < aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres – aldehídos – cetonas < alcoholes – aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos

MECANISMO Desplazamiento Competición entre moléculas de FM y analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

APLICACIONES Apolares a medianamente polares Peso molecular < 5000 Poco solubles en agua Generalmente complementario a reparto Amplio rango de aplicación Bueno para separar isómeros Todas las ramas de investigación

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

C. De reparto Desarrollada como alternativa a c. de adsorción (fácil, reproducible; mejor resolución y vida útil que adsorción Más utilizada actualmente (fases enlazadas, HPLC) Modalidades líquido-líquido y fase enlazada Fase normal o fase reversa

FASES ESTACIONARIAS Película de fase estacionaria líquida o pseudo- líquida unida a soporte Idealmente el soporte no interacciona Unión de FS física (c. líquido-líquido) o química (c. de fase enlazada) Sangrado de columna

Sangrado

Fases líquidas Preparación por varios métodos. Evaporación de solvente Recubrimiento directo Precipitación Recubrimiento dinámico Para fase normal: agua, formamida, glicerol, polialcoholes Para fase reversa: escualano, octanol, hidrocarburos grandes

Fases enlazadas Unión con enlace covalente de cadena orgánica (grupo funcional) al soporte Funcionalización de la cadena, longitud de la cadena, grado de recubrimiento del soporte Polaridad, capacidad, retención.

Fases enlazadas

Fases enlazadas

FASES MÓVILES De acuerdo a la polaridad de analito y fase estacionaria Influye sobre la estructura de la fase estacionaria Sus variaciones influyen en la resolución Índice de polaridad (sol. En dioxano, nitrometano y etanol)

Efecto sobre FS

Propiedades

MECANISMO Basado en polaridad Polaridad analitos: Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes

Relaciones de polaridad FS

Relaciones de polaridad FM

Variación de k’

Variación de α

APLICACIONES Tradicionalmente, analitos polares de bajo a medio peso molecular En general, mayoría de analitos, con la técnica adecuada

Aplicaciones

Ejemplos

CASOS ESPECIALES Derivatización C. de pares iónicos C. con fases quirales

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

C. De afinidad Mecanismo de retención basado en interacciones ESPECÍFICAS reversibles, propias de los sistemas biológicos (interacción antígeno-anticuerpo, enzima sustrato) Modelo llave-cerradura

FASES ESTACIONARIAS Fase estacionaria: inmobilización al soporte (unión química) de uno de los componentes de un par (ligando de afinidad) Ligandos generales y ligandos de alta especificidad Ligandos de origen natural o sintético

FASES ESTACIONARIAS Soporte: baja retención de analitos en general, fácil modificación (unión de ligandos), estable a condiciones de análisis Bajo rendimiento: material no rígido, de partícula grande (geles orgánicos) Alto rendimiento: rígido, partícula pequeña (sílica, vidrio, poliestireno)

C. De afinidad

FASES MÓVILES Elución por fases Inyección del analito, en presencia de FM con las condiciones adecuadas para la unión ligando- analito (composición, pH, fuerza iónica). Fase móvil débil Elución del analito en presencia de FM que los desplaza o promueve la disociación del complejo ligando-analito. Fase móvil fuerte

Tipos de elución Elución inespecífica Elución bioespecífica Elución bioespecífica en fase normal Elución bioespecífica en fase reversa OJO En este tipo de cromatografía fase normal y fase reversa NO se refieren a polaridad

Tipos de elución Normal: El buffer de elución contiene un agente que compite con el ligando por unirse con el soluto. Reversa: El buffer de elución contiene un agente que compite con el soluto por unirse con el ligando. La elución no específica, debilita el enlace.

MECANISMO

Elución bioespecífica

APLICACIONES Biomoléculas Moléculas con efecto biológico Células

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

C. De intercambio iónico Basado en los equilibrios de intercambio entre los distintos iones de una solución sobre la fase estacionaria Competición entre iones de FM y de analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

FASES ESTACIONARIAS Sólido de elevada masa molecular, insoluble en FM, superficie con grupos funcionales ionizables Naturales (arcillas, zeolitas) o sintéticos (resinas)

Clasificación según tipo analito Intercambiadores catiónicos Intercambiadores aniónicos

Clasificación según forma Fases estacionarias porosas: Copolímero estireno-divinilbenceno como soporte, superficie modificada con grupos ionizables Fases estacionarias peliculares: Partículas esféricas no porosas de soporte (vidrio, polímero, sílica) con película de resina de intercambio

FASES MÓVILES Soluciones acuosas con o sin modificadores orgánicos (metanol) Contienen sustancias iónicas (buffer) pH controla ionización de FS  controla retención/elución Fuerza iónica controla competición contra analito  controla elución

MECANISMO http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5- 5.html 

Retención Polivalentes más que monovalentes Para grupos con la misma carga, las diferencias de retención se dan por tamaño del ión hidratado y otras propiedades

APLICACIONES Analitos iónicos, bajo a medio peso molecular Orgánicos e inorgánicos Fármacos, metabolitos, alimentos

Aplicaciones

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

C. De exclusión molecular Exclusión por tamaño Basado en la capacidad de penetración de los analitos en los poros de la FE de acuerdo con su tamaño (y en menor medida con su forma)

FASES ESTACIONARIAS Red de poros uniforme, a manera de tamiz Poca interacción con el analito (evitando otros mecanismos de retención) Partículas de sílica o poliméricas Polímeros orgánicos o inorgánicos Geles hidrofóbicos o hidrofílicos

Propiedades FS Tamaño promedio de poro impone límites a la separación (porosidad o grado de enrecruzamiento). Límite de exclusión: Peso molecular por encima del cual no se retienen las moléculas Límite de penetración: Peso molecular por debajo del cual hay libre penetración

FASES MÓVILES Capaz de disolver completamente los analitos En este tipo de c. NO existe fase normal y reversa: Filtración sobre gel: rellenos hidrofílicos y solventes acuosos Penetrabilidad sobre gel: rellenos hidrofóbicos y solventes orgánicos no polares

MECANISMO http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5- 6.html 

APLICACIONES Moléculas grandes, amplio rango de polaridad Biomoléculas Polímeros

Aplicaciones de la C. líquida

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓN Fin