Diagnóstico Genético Prenatal

Frecuencia: 3% de los Recién Nacidos Vivos Defectos Congénitos Frecuencia: 3% de los Recién Nacidos Vivos . Genéticos: . Cromosómico . Monogénico . Poligénicos o Multifactoriales . Ambientales: . Agentes Físicos . Agentes Biológicos . Agentes Químicos . Aún Desconocidos

Agentes ambientales -Teratología Defectos Congénitos Agentes ambientales -Teratología Un teratógeno es un agente ambiental (droga o químico, radiación, infección, etc.) que interfiere con el desarrollo normal del embrión o feto y que da como resultado la pérdida de embarazo, malformaciones, restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) o cambios conductuales en el recién nacido.

Factores ambientales Anomalías de origen ambiental Agentes físicos: Radiaciones ionizantes Agentes químicos: Alcohol Medicamentos Exposición laboral Agentes biológicos: Citomegalovirus (CMV) Toxoplasmosis Rubeola Parvovirus B19

En el embrión previo a la implantación Clasificación del diagnóstico prenatal Métodos no invasivos Métodos invasivos Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD) En el feto En el embrión previo a la implantación

Tendencia actual: screening a todas las embarazadas que deseen realizar algún tipo de estudio El screening es un método que aplicado a nivel masivo evalúa riesgos individuales. Un screening positivo indica que el paciente tiene riesgo elevado para la enfermedad buscada, y que por lo tanto se podría beneficiar con un procedimiento diagnóstico más preciso como la amniocentesis o la aspiración de vellosidades coriónicas. Actualmente el screening prenatal de anomalías de cromosomas incluye la edad materna y los antecedentes reproductivos, análisis bioquímicos en sangre de la madre y datos de la ecografía (ej.: translucencia nucal).

Métodos No Invasivos de Diagnóstico Prenatal Imágenes - Ecografía (2D, 3D, 4D) - Doppler - Resonancia Magnética - Tomografía Computada Helicoidal Marcadores bioquímicos en sangre materna Ácidos nucleicos fetales en sangre materna

Translucencia Nucal y Hueso Nasal Feto de 12 semanas con hueso nasal presente (flecha corta) y translucencia nucal de 1,9 mm (flecha larga). Interpretación: bajo riesgo para anomalías de cromosomas.

Translucencia Nucal (TN) y Hueso Nasal (HN) * Feto de 12 semanas con HN presente y TN de 1,2 mm. Bajo riesgo para anomalías de cromosomas Feto de 12 semanas con HN ausente (flecha) y TN de 8 mm (*). Alto riesgo para anomalías de cromosomas. Luego del asesormiento se realizo aspiración de vellosidades coriónicas. Cariotipo: 47,XY,+21

Ácidos nucleicos libres en sangre materna ADN y ARN Real-time PCR A partir de la 6ta semana de amenorrea Permite identificar secuencias no presentes en la madre Factor Rh del feto en madres Rh negativas sensibilizadas Sexo fetal (enfermedades ligadas al X) Mutaciones paternas: dominantes y recesivas Se podría realizar diagnóstico prenatal de anomalías de cromosomas

Seguimiento de la paciente Rh negativa sensibilizada

ADN fetal libre en sangre materna Curva de Amplificación Rh pos Rh neg

Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal OTROS AMNIOCENTESIS CORDOCENTESIS PUNCIÓN DE VELLOSIDADES CORIÓNICAS

Aspiración de vellosidades coriónicas MUESTRA: Cualquier tejido con células nucleadas que estén en división celular Aspiración de vellosidades coriónicas Amniocentesis Cordocentesis Cariotipo fetal Identifica enfermos Respuesta definitiva

Laboratorio en diagnóstico prenatal Citogenética clásica Citogenética molecular (FISH) Análisis bioquímicos Análisis moleculares PCR Real-time PCR QF-PCR CGH Microarrays

Cariotipo con bandeo G: 46,XY Metafase Cariotipo

Trisomía 21: 47,XX,+21

Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal Tienen certeza, pero ... tienen poca disponibilidad tienen un costo elevado presentan riesgos fetales

Indicaciones Principales de Diagnóstico Prenatal Invasivo Edad materna avanzada Hijo previo con anomalía de cromosomas Padres portadores de rearreglos cromosómicos Detección ecográfica de una malformación Riesgo elevado por screening prenatal Obtención de material para análisis de ADN

Características de los estudios de cariotipo prenatal Aspiración de Vellosidades coriónicas Amniocentesis Cordocentesis Edad gestacional a partir de las 11 semanas A partir de las 16 semanas A partir de las 18 semanas Tiempo para el resultado 7 días 21 días 5 a 10 días Riesgos de pérdida de embarazo 0,5%-1% 0,3%-1% 2%-3% Certeza 99,5% 99,9%

Mosaicismo en Vellosidades Coriónicas Presencia de más de una línea celular, con distintos cariotipos, en el tejido estudiado.

Mosaicismo Confinado a la Placenta 46,XY Error mitótico postcigótico 45,X/46,XX 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY EMBRIÓN PLACENTA 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 45 X 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 45 X 45 X 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 45 X 45 X 45 X 45 X 46,XY 45,X 46,XY

Mosaicismo Confinado a la Placenta Error meiótico y rescate trisómico 47,XY,+2 46,XY/47,XY,+2 47 47 47 47 46 46 47 47 47 47 47 47 46 XY 46 XY 47 46 XY 47 46 XY 46 XY 47 47 47 47 47 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY EMBRIÓN PLACENTA 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 47 46 XY 47 46 XY 47 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 47 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46, XY 46 ,XY 47, XY,+2 46 ,XY

Mosaicismo placentario y fetal Error meiótico 47,XY,+21 46,XY/47,XY,+21 47 47 47 47 46 46 47 47 47 47 47 47 47 47 46 XY 47 46 XY 47 47 46 XY 46 XY 47 47 47 46 XY 46 XY 46 XY EMBRIÓN PLACENTA 47 46 XY 47 47 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 47 46 XY 47 46 XY 46 XY 47 47 47 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 46 XY 47 47 47, XY,+21 47, XY,+21 46, XY 46 ,XY 46 ,XY

MOSAICISMO en Vellosidades Coriónicas Implicancia clínica Cromosoma involucrado Causa por la que se realizó el estudio prenatal Ecografía fetal normal o patológica ¿Qué hacer? Amniocentesis: cariotipo y FISH

FISH en diagnóstico prenatal Mosaicismo de trisomía 21 en vellosidades coriónicas. Amniocentesis + FISH: en células de líquido amniótico se observan 3 señales rojas que indican que hay 3 cromosomas 21 y 2 señales verdes que indican que hay 2 cromosomas 13. Diagnóstico final: trisomía 21

FISH en diagnóstico prenatal Ventajas No necesita cultivo celular Se pueden analizar muchas células (>100) Resultados en 24-48hs Desventajas Menor exactitud que el cariotipo convencional Alto costo

QF – PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction En diagnóstico prenatal Detecta TRISOMÍAS MONOSOMÍAS TRIPLOIDÍAS SENSIBILIDAD 95,65 % 99,2 – 100 % ESPECIFICIDAD 99,97 %

QF – PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction Amplifica selectivamente secuencias del ADN Determina el número de copias de una secuencia determinada de ADN ADN extraído de células NO cultivadas de Vellosidades Coriónicas o Líquido Amniótico Amplificar regiones de ADN (marcadores polimórficos) específicos de cromosoma (13, 18, 21, X, Y) Computadora mide la intensidad de la señal fluorescente: determina cantidad de copias

QF – PCR Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction La amplificación de los marcadores genera un producto fluorescente que es directamente proporcional a la cantidad de secuencia target en la muestra inicial Evaluar simultáneamente hasta 15 STR de loci preseleccionados de ciertos cromosomas

QF – PCR Resultado Resultado: valor numérico correspondiente al área y altura de los picos En normales heterocigotas para el STR, la misma cantidad de fluorescencia se genera por ambos alelos.

TRISOMÍA: 3 PICOS 2 PICOS DISTINTOS Tener por lo menos 2 marcadores informativos por cromosoma

QF – PCR VENTAJAS Resultado RÁPIDO de anomalías cromosómicas numéricas: Detecta TRIPLOIDÍA Detecta MOSAICISMO 20 – 30 % Lectura computarizada Automatización Puede amplificar en forma simultánea aproximadamente 15 loci

QF – PCR VENTAJAS Mejor que cariotipo convencional y FISH en detectar contaminación materna celular Procesa muestras simultáneamente Menor costo

EUPLOIDE: 46,XX

TRISOMÍA 21

Otras técnicas moleculares aplicadas al diagnóstico prenatal MLPA: Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification ARRAY – CGH: Array comparative genomic hybridization

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification VENTAJAS Mejor que secuenciación en que detecta deleciones y duplicaciones de exones completos Mejor que FISH en que detecta mutaciones pequeño tamaño Mejor que PCR ya que ésta no puede evaluar secuencias tan pequeñas

Array-CGH

Array comparative genomic hybridization ARRAY – CGH Array comparative genomic hybridization Evalúa cambios en el número de copias (CNV) en el genoma entero causadas por DELECIONES, DUPLICACIONES, ANEUPLOIDIAS, TRANSLOCACIONES DESBALANCEADAS. Resolución 50-100 kb Análisis simultáneo de 10 a 100 loci Algunas plataformas evalúan cambios tan pequeños como un exón. No necesita cultivo Resultado: 48hs

ARRAY - CGH

TIEMPO Cant loci por muestra COSTO CARIOTIPO “clásico” FISH QF-PCR TIPO ESTUDIO RESOLUCION TIEMPO Cant loci por muestra COSTO CARIOTIPO “clásico” 5 – 10 Mb VC: 7 – 10 días Amnio: 15 – 21 días Bajo FISH 1 – 5 Mb 24 – 48 hs Sólo algunas sondas por muestra Caro QF-PCR 24 hs HASTA 15 loci MLPA 130 – 500 bp Hasta 50 loci Muy caro Array 50 – 100 kb 48 hs Hasta 180.000 loci

Reproducción Médica Asistida

Conceptos claves Conjuntos de métodos biomédicos que conducen a facilitar o sustituir en parte a los procesos biológicos naturales, deteriorados o inexistentes, que se desarrollan durante la procreación humana. No suplantan mediante elementos artificiales o no biológicos al organismo masculino o femenino en la función procreativa. Implican la participación de los gametos masculinos y femeninos en el proceso generativo. No curan la infertilidad. Incluyen la intervención de un tercero (el médico, el biólogo, la sociedad, etc.) en la generación de un nuevo ser humano, por lo cual presentan intensas implicancias bioéticas.

Clasificación Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida

Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (I) Inseminación artificial (IA) Indicaciones: Subfertilidad o infertilidad masculina, vasectomía, oligo / azoospermia, ac. anti-esperma, impotencia. Normalidad anatómica y funcional del aparato reproductor femenino. Metodología: 1. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 2. Transferencia de los espermatozoides mediante un catéter hasta la vagina. -Porcentaje de Éxito: 5 a 10% por tratamiento / por ciclo.

Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (II) Transferencia intratubárica de gametos (GIFT) Indicaciones: Infertilidad por razones inmunológicas que impiden la capacitación natural del espermatozoide, existencia de un factor cervical femenino que altere a los espermatozoides, anovulación. Metodología: 1. Inducción de la ovulación por hiperestimulación ovárica y recogida de los ovocitos por vía transvaginal. 2. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 3. Transferencia, mediante un catéter del óvulo y los espermatozoides hasta la porción ampular de la trompa. Porcentaje de Éxito: 24.5% por tratamiento / por ciclo.

Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (I) Fecundación In Vitro con Transferencia de Embriones (FIVET)

Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (II)

Indicaciones y Factores Pronóstico Nº de embriones transferidos Éxito de embarazo 1 11.5% 2 27.5% 3 33.8% 4 36.1% 5 35.1% 6 38.2% Edad materna Éxito de Embarazo < 35 años 33.8 % 35 – 39 años 27.5% > 40 años 11.5 %

Complicaciones de las Técnicas de Reproducción Asistida Embarazos múltiples Morbi-mortalidad materna y fetal aumentada (abortos, partos prematuros, anemia, eclampsia, polihidramnios, endometritis, malformaciones congénitas, etc.) Incremento en los gastos de los servicios de maternidad y neonatología. Efectos psicológicos en la madre, pareja y familia

Diagnóstico Genético de Pre-implantación

Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD) Surgió en la década de 1960, pero a partir de su asociación a IVF, se convirtió en un método de “prevención” de desórdenes genéticos. Se encuentra indicado en: edad materna ≥ 36 años, parejas con ≥ 3 IVF fallidos, parejas con MESA o TESA y ≥ 1 IVF fallido, abortos recurrentes, desórdenes monogénicos, anormalidades cromosómicas, cariotipo alterado debido a mosaicismo cromosómico o translocaciones balanceadas. En todos los casos en que se efectúe PGD, es imprescindible contar con hiperestimulación ovárica previa y técnicas de reproducción asistida extracorpóreas con el objetivo de generar in vitro múltiples embriones para seleccionar aquellos que no se encuentran afectados.

Embrión descartado Incubación (3 días) Desorden genético excluido Desorden genético detectado

HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH) Cromosoma 13: rojo Cromosoma 21: verde Cromosoma 18: celeste Cromosoma X: azul Cromosoma Y: dorado

Complicaciones de la PGD Daño estructural al embrión (raro) Sólo ¼ de los embriones biopsiados puede implantarse satisfactoriamente No descarta el mosaicismo genético Errores diagnósticos El resultado de la PGD debe confirmarse por amniocentesis y biopsia de vellosidades coriónicas