Enzimas Marcela Bernal Múnera BIOL3051 Laboratorio 5 Enzimas Marcela Bernal Múnera BIOL3051

Objetivos Definir qué es una enzima y cómo ésta actúa en las reacciones dentro de la célula. Identificar los diferentes factores que pueden afectar la actividad enzimática. Diferenciar entre inhibición competitiva y no- competitiva.

Introducción Las enzimas son en su mayoría proteínas o RNA (riboenzimas). Son catalizadores químicos que agilizan una reacción química que involucra la formación o rompimiento de enlaces químicos. No se consumen ni se alteran en las reacciones. Al finalizar la reacción la enzima se libera y queda disponible para otra reacción.

Introducción Actúan sobre un sustrato formando un complejo enzima-sustrato al unirse en un lugar específico del sustrato: sitio activo de la enzima. Las enzimas son selectivas, pocas moléculas pueden interactuar con el sitio activo y formar el complejo (figura 1).

Fig. 1: Reacción con participación de una enzima.

Fig. 2: Energía de activación necesaria para iniciar la reacción. Cuando se forma esta interacción baja la energía de activación necesaria para poder llevar a cabo la reacción.

Enzimas en una reacción Funcionan mejor bajo condiciones específicas (óptimas) que incluyen: Temperatura pH Los cambios pueden alterar el desempeño de la enzima, desactivarla o destruirla. Algunas enzimas necesitan activadores para poder formar el complejo enzima-sustrato.

Cofactores e Inhibidores Activadores que cambian la conformación de la enzima para formar el complejo enzima-sustrato reciben el nombre de cofactores: pueden ser iones metálicos (nada orgánico). de origen orgánico se llaman coenzimas.

Cofactores e Inhibidores Los inhibidores impiden la actividad de la enzima, como el pH y la ºT. Pueden afectar el sitio activo de de dos maneras: Competitiva: Bloquea el sitio activo (Fig. 3). No competitiva: Altera indirectamente la forma del sitio activo, al pegarse en otro lugar de la enzima (Fig. 4).

Fig. 3: Inhibición competitiva

Fig. 4: Inhibición no competitiva

Ejemplos de enzimas: Catalasa Se encuentra en casi todas las células aeróbicas. Actúa rompiendo el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno que se produce en las células: Observaremos su funcionamiento en varios organismos. 2 H2O2 catalasa 2 H2O + O2

Ejercicio 1: Funcionamiento de la catalasa en varios organismos. Corte en pedazos (por separado) las muestras de papa, hígado, setas y espinaca. Coloque pedazos pequeños en las fosas de la placa de porcelana; añada 3 gotas de peróxido de hidrógeno a cada muestra. Observe y anote los resultados en la tabla 1. Preparación de homogenados: En una licuadora o mortero, muela (por separado) con un poco de agua hasta diluir parte de la muestra, no mucho para queden pedazos pequeños. De ser necesario filtrar con gasa. Ponga cada homogenado en un tubo de ensayo.

Tabulación de resultados Tabla 1. Resultados homogenado con peróxido de hidrógeno Homogenado Reacción al añadir gotas del peróxido Agua Papas Hígado Espinaca Setas

Preguntas 1. ¿Qué ocurrió al añadir el peróxido?   2. ¿Ocurrió lo mismo para todas las muestras? 3. ¿Por qué se forman las burbujas? 4. ¿Qué otros organismos podrían usarse para esta prueba?

Ejercicio 2: ¿Se comportan todos los organismos de la misma manera? 1. Marque 5 tubos de ensayo con las letras de la A a la E 2. Ponga 3 ml de cada homogenado en los tubos como sigue: A - Hígado B - Papa C - Setas D - Espinaca E - Agua 3. Haga una marca hasta donde llega cada homogenado.

Ejercicio 2: ¿Se comportan todos los organismos de la misma manera? 4. Ponga 3 ml de peróxido de hidrógeno en cada tubo de ensayo. 5. Observe la reacción que sucede en cada tubo y marque el cambio en el nivel del líquido. 6. Tabule los resultados en la tabla 2. 7. REPORTE CORTO DE ESTE EJERCICIO: MATERIALES Y MÉTODOS.

Tabulación de resultados Tabla 2. Resultados homogenado con peróxido de hidrógeno Tubo Cantidad de burbujas ¿Cuánto homogenado se consumió? A B C D E

Preguntas 5. ¿Qué organismo produjo más gas? 6. ¿Qué gas se está produciendo? 7. ¿Qué sugieren los resultados sobre la fisiología de estos organismos?

Ejercicio 3: Efecto de la temperatura sobre el funcionamiento de las enzimas. Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad. A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas“, la actividad se detiene y cuando se supera un valor considerable la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.

Procedimiento Rotule 5 tubos de ensayo y caliente un baño de H20 hasta 80°C, y otro hasta 37°C. 2. Añadir 2 ml de hígado homogenado a cada uno. 3. Mantenga los tubos a las siguientes temperaturas: Tubo 1 = 80°C (poner tubo por 5 minutos). Tubo 2 = 37°C (poner tubo por 5 minutos). Tubo 3 = Temperatura ambiente. Tubo 4 = En hielo (dejar por 30 minutos). Tubo 5 = En congelador a 4°C (dejar por 30 minutos).

Procedimiento 4. Añada 2 ml de peróxido al tubo 1. 5. Observe los resultados y el tiempo que tardan en producirse las burbujas (tome el tiempo inicial al añadir el peróxido y el tiempo cuando empiezan a producirse las burbujas). 6. Repita con los demás tubos. 7. Compare sus resultados en término de tiempo de reacción vs. temperatura en la tabla 3.

Tabulación de resultados Tabla 3. Resultados del efecto de temperatura Tubo Temperatura Tiempo 1 2 3 4 5

Preguntas 8. ¿Cuál es la relación entre la temperatura y la actividad enzimática? 9. ¿Qué le sucede a las enzimas cuando se exponen a temperaturas extremas (muy frías o muy calientes)?

Ejercicio 4: El efecto del pH sobre el funcionamiento de las enzimas Todas las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras: El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH. El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH. Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un óptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12

Procedimiento 1. Rotule 3 tubos de ensayo A, B y C. 2. Añada 1 ml de homogenado de hígado a cada tubo. 3. Añada 3 ml de HCL 3M al tubo A. 4. Añada 3 ml de NaOH 3M al tubo B. 5. Añada 3 ml de agua al tubo C (control, sin ácido ni base). 6. Añada 3 ml de peróxido de hidrógeno a los 3 tubos. 7. Observe y anote las reacciones en la tabla 4.

Tabulación de resultados Tabla 4. Resultados del efecto de pH Tubo Tiempo de reacción Descripción de la reacción A (HCL) B (NaOH) C (Control)

Preguntas 10. ¿Cuál es la relación entre el pH y la actividad enzimática? 11. Las enzimas del estómago funcionan mejor con un pH de 2. ¿Cómo afectaría un pH de 4 en el estómago a la digestión?