Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune ALPS Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune Residencia de Inmunología para Bioquímicos. Bioq. M. Silvana Bertone Bioq. Lorena Zanella

Apoptosis en la fisiología animal Embriogénesis – Desarrollo Homeostasis Eliminación de tejidos dañados o infectados Regulación del Sistema Inmune

Homeostasis Linfocitaria Desarrollo del repertorio inmune - Selección positiva; “death by neglect” - Selección negativa Mantenimiento de células quiescentes en periferia Expansión de clones antígeno específicos Memoria inmunológica

Muerte Celular Necrosis Apoptosis Definición Muerte accidental Muere celular Programada Estímulo Injuria directa Mediada por sensores externos e internos Integridad Celular Desintegración de organelas Pérdida de integridad de la membrana Organelas sin lesiones específicas Membrana celular intacta Condensación citoplasmática y nuclear. Tamaño/Vol. celular -/Aumentado Esférica/Disminuido Destino Lisis celular Fagocitosis de cuerpos apoptótico (Translocación de PS hacia el exterior) Inflamación Liberación de enzimas lisosomales Daño tisular y respuesta inflamatoria Sin respuesta inflamatoria Gasto Energético Sin gasto de energía Procesos dependientes de energía Requiere nueva expresión de genes Ciclo Celular No asociado Asociado DNA Degradación del DNA al azar Fragmentación del DNA no al azar en mono- y oligonucleosomas

Necrosis - Apoptosis

Exocitosis de gránulos: Vías de la Apoptosis Vía Extrínseca: Receptores de Muerte Vía no secretoria Vía Intrínseca: Mitocondrial Exocitosis de gránulos: Granzimas y perforinas Vía secretoria

Receptores de Muerte: FAS - FASL Vía Extrínseca: Receptores de Muerte: FAS - FASL DISC CASPASAS

Gen Fas

Vía Intrínseca: Mitocondrial

Apoptosis – Vías Intrínseca y Extrínseca

Síndrome Linfoproliferativo autoinmune (ALPS). Aspectos Históricos 1967: Canale y Smith describieron cinco pacientes con linfoproliferación no maligna crónica (linfoadenopatía, esplenomegalia), citopenias autoinmunes y  de  globulinas. 1992: Sneller et al observó que estos pacientes además tenían una población de células T con fenotipo CD3+ CD4- CD8- (DN) TCR + aumentada. En el mismo año, Watanabe- Fukunaga et al reconocen la conección entre estos pacientes y un modelo de ratón (mutantes lpr y gld ), los cuales no expresaban en la superficie celular CD95 o Fas, receptor responsable de la apoptosis de linfocitos activados. 1995: Fisher et al , Rieux-Laucat et al demostraron en un grupo de pacientes con el síndrome clínico, defectos en apoptosis de linfocitos y mutaciones en Fas 1999: Strauss et al propone una definición de la enfermedad.

Criterios Diagnósticos de ALPS Requeridos: Acumulación crónica de LT no malignos. (linfoadenopatía +/- esplenomegalia). Mayor a 2% de células T CD3+ CD4- CD8- (DN) TCR + en sangre periférica o cortes histológicos. Generalmente presentes: Autoanticuerpos y autoinmunidad Datos adicionales que apoyan al diagnóstico: Historia familiar de ALPS. Ensayo de Apoptosis in vitro mediada por Fas defectuosa Hallazgos típicos histopatológicos en nódulos linfáticos o tejido linfoide Linfoma Diagnóstico Definitivo Mutaciones en genes que codifican proteínas de vía de apoptosis

Características Clínicas Linfoproliferación Proliferación no maligna de linfocitos (100%) Linfoadenopatías (87%) Esplenomegalia (90%) Hepatomegalia (75%) Autoinmunidad Anemia hemolítica autoinmune (53%) Trombocitopenia/ Neutropenia autoinmune (31-44%) Glomerulonefritis (8%) Hepatitis autoinmune (6%) Neoplasias Linfomas (Hodgkin y no Hodgkin) (9%) Carcinomas (tiroides, piel, hígado) (6%)

EDAD PRESENT./ SEVERIDAD Clasificación TIPO MUTACIÓN EDAD PRESENT./ SEVERIDAD ALPS 0 Deficiencia completa de Fas Prenatal/Severo

EDAD PRESENT./ SEVERIDAD Clasificación TIPO MUTACIÓN EDAD PRESENT./ SEVERIDAD ALPS 0 Deficiencia completa de Fas Prenatal/Severo ALPS Ia TNFRSF6 (Fas) Infancia/ Moderado-Severo

EDAD PRESENT./ SEVERIDAD Clasificación TIPO MUTACIÓN EDAD PRESENT./ SEVERIDAD ALPS 0 Deficiencia completa de Fas Prenatal/Severo ALPS Ia TNFRSF6 (Fas) Infancia/ Moderado-Severo ALPS Ib TNFSF6 (Fas L) Adultez/LES

EDAD PRESENT./ SEVERIDAD Clasificación TIPO MUTACIÓN EDAD PRESENT./ SEVERIDAD ALPS 0 Deficiencia completa de Fas Prenatal/Severo ALPS Ia TNFRSF6 (Fas) Infancia/ Moderado-Severo ALPS Ib TNFSF6 (Fas L) Adultez/LES ALPS II Caspasa 8 o Caspasa 10 Infancia/ Moderado

EDAD PRESENT./ SEVERIDAD Clasificación TIPO MUTACIÓN EDAD PRESENT./ SEVERIDAD ALPS 0 Deficiencia completa de Fas Prenatal/Severo ALPS Ia TNFRSF6 (Fas) Infancia/ Moderado-Severo ALPS Ib TNFSF6 (Fas L) Adultez/LES ALPS II Caspasa 8 o Caspasa 10 Infancia/ Moderado ALPS III ? Infancia/ Moderado

Laboratorio en ALPS Hallazgos Hematológicos Perfiles químicos Linfocitosis, frecuentemente asociada con linfocitos atípicos en el frotis. Anemia, con o sin hemólisis. Deficiencia de Hierro. Reticulocitosis. Trombocitopenia/ Neutropenia Algunos pacientes presentan eosinofília. Perfiles químicos Generalmente normal. Enzimas hepáticas . Bilirrubina conjugada . Colesterol . Albúmina 

Laboratorio en ALPS Perfil Inmunológico: Expansión policlonal de células T CD3+ CD4- CD8- (DN) TCR/+ expresión de marcadores de activación HLA DR+, CD57+.  células TCD4+/CD25+ (T regulatoria).  células B CD20+/CD27+ (B Memoria). IgG, IgA, IgE , IgM N o  . Autoanticuerpos: Anticardiolipina y test Coombs directo o indirecto (+), Anticuerpos anti- plaquetas, anti- neutrófilos, FAN, FR generalmente positivos. Complemento N (salvo paciente ALPS Ib). 0.2% 33.7%

Ensayo de inducción de Apoptosis in vitro vía Fas DIA 0: -Obtención de sangre heparinizada en condiciones estériles (paciente y control normal del día). -S -S -Separación de CMNT por gradiente de Ficoll-Hypaque. -C -Cultivo con fitohemaglutinina (PHA), en estufa gaseada 2 días DIA 3: -Agregado de IL-2 DIA 6 y 8:Renovación del medio de cultivo DIA 9: -Agregado del Ac. monoclonal Anti Fas (simulando ser FasL) en distintas concentraciones y por duplicado. Incubación de 1h en estufa gaseada G -Agregado del segundo Ac. Monoclonal RAMIG DIA 10: - Medición del % de núcleos apoptóticos por Citometría de Flujo después del tratamiento con solución hipotónica de Ioduro de Propidio (IP). La prueba funcional de apoptosis se expresa en % de núcleos apoptóticos referidos al control del día.

Medición de células muertas por CF (+) PHA (48 hs.) Expandidas con IL 2 (72 hs.) CMNT Células activadas Linfocitos Anti Fas (1 hs). Medición de células muertas por CF

Casos Clínicos Sexo/Embarazo Mujer/RNT/PAEG Varón/RNT/PAEG Datos Perinatológicos Esplenomegalia, Plaquetopenia, AHA S/P Consulta Servicio de Inmunología 4 mes: Linfoproliferación, AHA, Plaquetopenia 15años: Linfoadenopatías Plaquetopenia 8 años: Recurrentes neutropenias febriles, Poliadenopatías Laboratorio Bicitopenia (GR y pts) Hipergamaglobulinemia (IgG, IgM, IgA) Bicitopenia (GB, pts) Hipergamaglobulinemia (IgM, IgA) Autoinmunidad Coombs + FR+, FAN+, ASMA+ Anticardiolipinas + Coombs + ASMA+ Antecedentes Fliares. Cosanguineidad, hermano fallecido Madre: 2 abortos No cosanguineidad LTCD3+ CD4-CD8- TCR a/b + 44% 5% 6% Prueba Funcional de apoptosis Ausente Disminuida Normal Diagnóstico Molecular Mutación homocigota exón 3 del gen FAS Mutación heterocigota exón 9 del gen FAS ALPS0 ALPS Ia ALPS III

Muchas Gracias por su atención!!!!!!!!!!

Hospital Garrahan Buenos Aires - Argentina