Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno. Sesarini C1, Giménez ML2, Redal M1, Argibay P1, Otaño L2. (1) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME (2) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia Hospital Italiano de Buenos Aires

Diagnóstico prenatal No invasivo Introducción Diagnóstico prenatal No invasivo Células fetales en sangre materna Técnicamente complejo Pocas células fetales en sangre A partir de las 15 semanas Vida media: 25-35 días. Pueden persistir por décadas ADN fetal libre en plasma materno Técnicamente más simple: PCR 3 a 6% del ADN libre A partir de las 6 semanas Vida media: 16 minutos Persisten hasta 2 hs. post-parto Durante el embarazo, la circulación materna y fetal están separadas por la “barrera” placentaria, no siendo completa ésta separación dado que se ha demostrado fehacientemente la presencia de células fetales y placentarias en circulación materna. Este fenómeno biológico abrió la posibilidad del uso de estas células con el fin de desarrollar una técnica de diagnóstico prenatal sin la necesidad de realizar procedimientos invasivos sobre el embarazo, evitando así el riesgo asociado a estos. Sin embargo, la rareza de estas células en sangre materna (de 1 a 6 células fetales cada mililitro de sangre materna), las dificultades metodológicas para identificarlas y analizarlas, y su persistencia en la circulación materna a lo largo de los años, han constituido un obstáculo insalvable para su uso clínico. Teniendo en cuenta que existen similitudes en varios aspectos entre la placenta y un tumor maligno, surgió la idea de investigar si de la misma manera que circulaba ADN tumoral libre en plasma de pacientes con cáncer, podía haber ADN de origen fetal en circulación materna. En 1997, Lo y col. demuestran por primera vez la presencia de secuencias ADN fetal masculino en plasma y suero materno. Las técnicas utilizadas para la detección del ADN fetal libre en circulación materna son más simples, rápidas y confiables que para la detección de células fetales en sangre materna, no requieren de los complejos procesos de enriquecimiento previo, y no existen dudas que el ADN fetal corresponde al embarazo en curso. En los primeros estadios del embarazo la concentración de ADN fetal libre en plasma es de 3,4% en un período de gestación temprano; mientras que en un período de gestación tardío es de 6,2% del total de ADN libre. La concentración de ADN fetal aumenta a medida que avanza el tiempo gestacional, con un incremento marcado durante las últimas 8 semanas de embarazo. Asimismo, no se detectan niveles de ADN fetal circulante luego de las dos horas post-parto, estimándose la vida media en 16,3 minutos (rango entre 4-30 minutos). Ha sido sugerido que el sistema renal es uno de los mecanismos responsable de la eliminación del ADN en plasma dado que se han reportado casos donde se detectó ADN fetal en orina de mujeres embarazadas. Se desconoce con precisión el origen de este ADN, sin embargo muchos autores sugieren que podría ser producto de células del trofoblasto que sufrirían apoptosis. Esta evidencia incluye la presencia de genes específicos de placenta en plasma materno, incluso la presencia de ADN fetal circulante luego que la placenta se ha formado y antes que el sistema circulatorio fetal se haya establecido.

Introducción Aplicaciones Diagnóstico Screening (Alelos Paternos) Sexo RHD Anomalías Génicas Preeclampsia? RCIU? Parto pretérmino? Aneuploidías? En la actualidad, el análisis del ADN fetal libre en plasma materno se limita a la evaluación de genes presentes en el feto pero no en la madre, como por ejemplo el RHD fetal en madres RHD negativo. RCIU: restricción de crecimiento intrauterino

Genotipificación del Rh fetal Introducción Genotipificación del Rh fetal Mujeres Rh (-) con Pareja Rh (+) heterocigota Pacientes no sensibilizadas Uso eficiente de la gammaglobulina - Escasa - Costosa - Exposición innecesaria a hemoderivados El conocimiento del factor Rh fetal en mujeres Rh negativas con parejas Rh positivas heterocigotas tiene implicancias directas en el manejo clínico. En la paciente no sensibilizada con diagnóstico de feto Rh negativo permitiría evitar la profilaxis con inmunoglobulina anti-RhD, un hemoderivado relativamente escaso y caro. Actualmente se recomienda la administración profiláctica de inmunoglobulina anti-RhD a las 28 semanas de amenorrea a toda embarazada Rh negativa con pareja Rh positiva. Sin embargo, se estima que entre 35 y 40% de estas embarazadas estarían gestando un feto Rh negativo siendo la administración de la inmunoglobulina innecesaria. Por otra parte, en las pacientes ya sensibilizadas, el conocimiento del Rh fetal es esencial para el asesoramiento y manejo del caso clínico, incluyendo procedimientos invasivos diagnósticos y terapéuticos. Hasta ahora, el Rh fetal sólo se podía conocer con un estudio invasivo sobre el embarazo, a través del análisis molecular del gen RHD en líquido amniótico o en vellosidades coriónicas; o por análisis convencional en sangre de cordón. Pacientes sensibilizadas Asesoramiento precoz Evitar procedimientos invasivos - Riesgo de pérdida - Mayor sensibilización

Determinación del sexo fetal Introducción Determinación del sexo fetal El diagnóstico de sexo genético prenatal requiere la extracción de material del embarazo. El análisis de ADN fetal en sangre materna permitiría evitar estos procedimientos y mejoraría el manejo perinatal de patologías como: - enfermedades ligadas al cromosoma X - virilización en HSC - malformaciones que afectan selectivamente a un sexo

Objetivo General Identificar y analizar marcadores de ácidos nucleicos fetales libres en sangre de embarazadas con el objeto de desarrollar un método no invasivo de diagnóstico prenatal de condiciones genéticas fetales y de patologías del embarazo con impacto sobre la salud materno-fetal.

Objetivos Evaluar la factibilidad y la eficacia diagnóstica de la determinación del genotipo RHD fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas Rh (-) Evaluar la factibilidad y la performance del diagnóstico de sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma materno. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la factibilidad y eficacia diagnóstica de la determinación del genotipo RHD fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas Rh negativo.

Materiales y Métodos Extracción de sangre (5 ml) de 60 embarazadas Rh (-), previa firma del consentimiento informado. Edad gestacional media: 27 semanas (rango: 7 a 41) Separación del plasma y extracción de ADN - Vi: 1000 μl - Vf: 40 μl Real Time-PCR: amplificación de una secuencia del gen RHD exón 7 (125 pb), marcador DYS14 del cromosoma Y (84 pb) y β-Actina (88 pb). Entre diciembre de 2007 y abril de 2008, se extrajo sangre a xx mujeres embarazadas Rh negativas que asistieron al Servicio de Obstetricia del Hospital Italiano de Buenos Aires, previa firma del consentimiento informado. El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética en Protocolos de Investigación (CEPI) del Hospital Italiano de Buenos Aires. La edad gestacional media al momento de la extracción de sangre fue de xx semanas (rango: xx a xx semanas). Se extrajeron entre 5 y 6 ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA. El plasma se separó por centrifugación dentro de las 2 horas pasada la recolección de la muestra y, dentro de las 24 horas se extrajo, por duplicado, ADN con el kit de extracción QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen ®). Para la extracción de ADN se siguieron las recomendaciones de manufactura con algunas modificaciones; el volumen inicial de plasma fue 1000 l y el volumen final de resuspensión del ADN fue de 40 l. Las muestras se amplificaron por duplicado utilizando un termociclador Real Time (Light Cycler, Roche ®) con primers específicos una secuencia del exon 7 del gen RHD de 125 pares de bases (pb) cuya secuencia se detalla a continuación: Se incluyeron controles positivos (ADN de mujer no embarazada RhD positivo) y negativos (ADN de mujer no embarazada RhD negativo). Se amplificó para cada una de las muestras una secuencia del gen β-actina de 88 pb como control interno de amplificación. Se calcularon la sensibilidad, especificidad, valores predictivos y exactitud de la prueba. Los investigadores involucrados con el procesamiento y análisis de las muestras permanecieron ciegos al Rh de la pareja de la embarazada y al Rh del recién nacido (RN).

Materiales y Métodos Resultados RhD positivo RhD negativo Sexo masculino Sexo femenino Se calculó - sensibilidad - especificidad - valor predictivo - exactitud de la prueba Entre diciembre de 2007 y abril de 2008, se extrajo sangre a xx mujeres embarazadas Rh negativas que asistieron al Servicio de Obstetricia del Hospital Italiano de Buenos Aires, previa firma del consentimiento informado. El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité de Ética en Protocolos de Investigación (CEPI) del Hospital Italiano de Buenos Aires. La edad gestacional media al momento de la extracción de sangre fue de xx semanas (rango: xx a xx semanas). Se extrajeron entre 5 y 6 ml de sangre periférica anticoagulada con EDTA. El plasma se separó por centrifugación dentro de las 2 horas pasada la recolección de la muestra y, dentro de las 24 horas se extrajo, por duplicado, ADN con el kit de extracción QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen ®). Para la extracción de ADN se siguieron las recomendaciones de manufactura con algunas modificaciones; el volumen inicial de plasma fue 1000 l y el volumen final de resuspensión del ADN fue de 40 l. Las muestras se amplificaron por duplicado utilizando un termociclador Real Time (Light Cycler, Roche ®) con primers específicos una secuencia del exon 7 del gen RHD de 125 pares de bases (pb) cuya secuencia se detalla a continuación: Se incluyeron controles positivos (ADN de mujer no embarazada RhD positivo) y negativos (ADN de mujer no embarazada RhD negativo). Se amplificó para cada una de las muestras una secuencia del gen β-actina de 88 pb como control interno de amplificación. Se calcularon la sensibilidad, especificidad, valores predictivos y exactitud de la prueba. Los investigadores involucrados con el procesamiento y análisis de las muestras permanecieron ciegos al Rh de la pareja de la embarazada y al Rh del recién nacido (RN).

Resultados Curva de Amplificación gen RH Electroforesis (gel de agarosa) de productos de amplificación. 125 pb 1: Ladder; 2-3: Feto Rh (+), duplicados; 4-5: Feto Rh (-), duplicados; 6: Control Rh (+); 7: Control Rh (-); 8: Agua Se detectó ß-actina en todas las muestras analizadas.

Análisis del gen RHD en plasma materno y Rh del RN Resultados Análisis del gen RHD en plasma materno y Rh del RN Rh de los RN Positivo Negativo Rh en plasma materno 33 6 39 2 19 21 35 25 60 Exactitud: 86,70% (52/60) Sensibilidad: 94,30% (33/35) Especificidad: 76,00% (19/25) Valor predictivo de RhD positivo: 84,60% (33/39) Valor predictivo de RhD negativo: 94,50% (19/21)

Resultados Embarazadas RhD negativas n: 60 Uso de Gammaglobulina Anti Rh D en base al resultado del análisis del ADN Fetal Embarazadas RhD negativas n: 60 Fetos RhD positivos n: 35 Fetos RhD negativos n: 25 Test positivo n: 33 Test falso negativo n: 2 Test falso positivo n: 6 Test negativo n: 19 Si aplicáramos a la clínica nuestros resultados, hubieran implicado esto ɣ-globulina No se aplicaría tratamiento necesario ɣ-globulina innecesario Ahorro de ɣ-globulina

Resultados Curva de aprendizaje de genotipificación RHD

Resultados Análisis del marcador DYS14 en plasma materno y sexo fenotípico del RN. Sexo de los RN Masculino Femenino DYS14 en plasma materno Positivo 38 2 40 Negativo 1 19 20 39 21 60 Exactitud: 95,00% (57/60) Sensibilidad: 97,44% (38/39) Especificidad: 90,48% (19/21) Valor predictivo sexo masculino: 95,00% (38/40) Valor predictivo sexo femenino: 95,00% (19/20)

Resultados Curva de aprendizaje de la determinación del sexo fetal

Discusión La amplificación de secuencias (RHD y DYS14) en embarazadas demuestra la factibilidad de realizar un diagnóstico prenatal no invasivo del Rh y sexo fetal a partir del análisis de ADN fetal en plasma materno. La determinación del Rh fetal en madres Rh (-) fue factible en la mayoría de los casos; exactitud 86,70% Problemas diagnósticos: - Primera etapa de la serie Falsos positivo (6) sin riesgo en la práctica clínica  contaminación, “vanishing twin” o variantes alélicas. Falsos negativo (2) baja concentración de ADN fetal La amplificación de secuencias del gen RHD fetal a partir del plasma de mujeres embarazadas Rh neg demuestra la factibilidad de realizar el diagnóstico prenatal no invasivo del Rh fetal a partir del análisis de ADN presente en circulación materna. De los xx embarazos evaluados para el gen RHD en plasma materno, en el xx% se predijo correctamente el Rh fetal. Las x discrepancias diagnósticas se produjeron en la primera etapa de la serie y correspondieron a resultados falsos positivos. Estas discrepancias podrían ser explicadas por contaminación con ADN ajeno a la muestra en estudio, persistencia de trofoblasto de un segundo embarazo detenido precozmente, denominado “mellizo desaparecido” o por verdaderas discrepancias genotipo-fenotipo debido a variantes alélicas del gen RHD. En relación a esto último, se debe tener en cuenta que la prueba involucra la amplificación de una región del exon 7 del gen RHD para determinar si el gen está presente en la muestra. En algunas variantes alélicas todo o parte del gen está presente pero el antígeno RhD no se expresa, ya sea por mutaciones o deleciones en el gen. Estas variantes, si bien son raras, pueden estar presentes en determinados grupos étnicos. No obstante, cabe destacar que los errores diagnósticos que correspondieron a resultados falsos positivos, carecen de relevancia clínica dado que no modifican la conducta habitual donde no se cuenta con ésta información. Por el contrario, resultados falsos negativos, no observados en el estudio, llevarían a omitir la profilaxis en la paciente no sensibilizada o perder la oportunidad de diagnóstico y tratamiento en la sensibilizada.

Discusión La asignación del sexo fetal se predijo correctamente en 57 de 60 embarazos evaluados (95%). Problemas diagnósticos: - Primera etapa de la serie - Falsos positivo (2): contaminación, “vanishing twin” - Falso negativo (1): baja concentración de ADN fetal Se han detectado secuencias de ARN fetal libre en plasma materno (Poon et al. 2000) Detección de secuencias de expresión placentaria (gen PLAC4, cromosoma 21) permitiría cuantificar niveles de expresión y podrían utilizarse para medir ploidía (Lo et al. 2007) La potencial aplicación clínica de una prueba para el diagnóstico no invasivo del Rh fetal debería basarse en la premisa de una muy alta sensibilidad (muy baja tasa de falsos negativos), aún si la estrategia utilizada se asocia con un detrimento de la especificidad (presencia de falsos positivos). Idealmente, la prueba debería tener una muy baja o nula presencia de discrepancias diagnósticas. Si bien la presente serie tiene un tamaño muestral demasiado pequeño para detectar diferencias significativas, la distribución de estos pocos casos de discrepancias que se observan, pareciera mostrar una disminución de casos a medida que progresa el protocolo compatible con una curva de aprendizaje. La factibilidad de analizar ácidos nucleicos (ADN y ARN) fetales sin poner en riesgo el embarazo a través de procedimientos invasivos como los que se han utilizado hasta ahora ha abierto un nuevo camino en diagnóstico prenatal. La detección de ácidos nucleicos libres en sangre de mujeres embarazadas también se extiende a la presencia de ARN fetal libre derivado de placenta en plasma materno. La presencia de ARN fetal libre fue comunicada por primera vez en el año 2000. La atención se ha centrado en el estudio del gen PLAC4 (placenta specific 4), cuya expresión es estrictamente placentaria y se localiza en el cromosoma 21, por lo que análisis cuantitativos de los niveles de expresión del ARNm de PLAC4 podrían ser utilizados para medir la ploidía del cromosoma 21. Actualmente, dentro de las principales aplicaciones del análisis de ácidos nucleicos de origen fetal libre en plasma materno se encuentran la determinación del Rh fetal, sexo fetal y algunas mutaciones génicas de origen paterno o que no estén presentes en la madre. Los próximos desafíos diagnósticos en esta área estarán dados por la evaluación diferenciada de los ácidos nucleicos de origen fetal de los maternos y la evaluación de aneuploidías cromosómicas.

Conclusión Aplicación en práctica clínica: mujeres Rh (-) no sensibilizadas limitaría profilaxis a fetos Rh (+) y sensibilizadas permitiría asesoramiento más preciso, realizando estudios invasivos sólo en embarazos con fetos Rh (+) La determinación del sexo fetal a partir de la semana 7 permitiría el manejo temprano de embarazos en riesgo de ciertas patologías. La inclusión de otra secuencia del gen RHD (exón 5) y del cromosoma Y (gen SRY), permitirán aumentar la especificidad del método. Desafíos diagnósticos: evaluación diferenciada de ácidos nucleicos fetales de maternos y evaluación de ploidía. De ésta misma manera, las observaciones de que las cantidades de ADN fetal se encuentran aumentadas en embarazos que desarrollarán trastornos como preeclampsia, restricción de crecimiento intrauterino y prematurez, no sólo permitirán mejorar los conocimientos sobre estas condiciones, sino que también abren nuevas posibilidades en el área de “screening” de estas patologías. En síntesis, la aplicación en la práctica clínica del estudio a través de plasma materno en mujeres RhD negativas no sensibilizadas limitaría la profilaxis durante el embarazo sólo a mujeres con fetos RhD positivo evitando una exposición innecesaria a un hemoderivado. Por otra parte, su aplicación en mujeres ya sensibilizadas permitiría un asesoramiento más preciso y limitar los estudios especiales e invasivos sólo a los embarazos con fetos RhD positivos. La inclusión de otra secuencia del gen RHD (exon 5), como sugieren muchos autores permitirá aumentar la especificidad del método.

Gracias por su atención.

Bibliografía Poon LL, Leung TN, Lau TK & Lo YM. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem 2000; 46: 1832-1834. Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Heung MM, Gerovassili A, Jin Y, Nicolaides KH, Cantor CR & Ding C. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med 2007; 13: 218-223. Hahn S & Chitty LS. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and future perspectives. Curr Opin Obstet Gynecol 2008; 20: 146-151.