Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología alimentaria R. Osta

Animal transgénico para la Esclerosis Lateral Amiotrófica Introducción 1/68

¿ Qué son los organismos modificados genéticamente? (Directiva 90/220/CEE) Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural. En la mayoría de los casos, la causa es desconocida pero existen muchas teorías propuestas para tratar de explicar por qué ocurre la enfermedad, como por ejemplo, ….. Es probable que no sea única la causa, sino una combinación de varios mecanismos, que tienen como vía final común la muerte de MNs. Definición 4/68

- Modificación genética en organismos unicelulares ¿Qué vamos a tratar?. - Modificación genética en organismos unicelulares -Modificación genética en organismos pluricelulares. - Aplicaciones de esta metodología y clonación. Indice 6/68

Modificación de organismos unicelulares: bacterias y levaduras.                                                                                               Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante                                                                                     Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante                                                                                     ¿Si vemos un video? Modificación de organismos unicelulares: bacterias y levaduras. Modificación genética en organimso unicelulares 6/68

Pero ,¿qué necesitaremos recordar? Introducción Definición 2/68

Estructura de un gen Intrones Exones PROMOTOR RNA (cDNA) PROTEÍNA En la mayoría de los casos, la causa es desconocida pero existen muchas teorías propuestas para tratar de explicar por qué ocurre la enfermedad, como por ejemplo, ….. Es probable que no sea única la causa, sino una combinación de varios mecanismos, que tienen como vía final común la muerte de MNs. PROTEÍNA Introducción 3/68

Al azar TRANSGÉNESIS Recombinación homóloga Tipos de transgénesis 5/68

TRANSGÉN GEN GENOMA Tipos de transgénesis 6/68

Al azar TRANSGÉN Concatémeros Gen crucial GEN Zonas metiladas Tipos de transgénesis 6/68

Recombinación homóloga TRANSGÉN GEN TRANSGÉN Tipos de transgénesis

¿De qué constará el ADN que queremos insertar? Expresión Localización de la expresión Regulación de la expresión. cDNA, DNA genómico. Promotor. Enhancer, elementos cis y trans. Transgénesis al azar 6/68

Transgén simple Promotor as1-antitripsina b-lactoglobulina humana bovina as1-antitripsina humana Transgénesis al azar 6/68

¿Por qué no lo pones en la pizarra que nos enteraremos más? Transgénesis al azar

Términos utilizados Knock-out: (fuera de combate) Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen. Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos. Transgénesis por recombinación homóloga

¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa? -Zona homólogas al gen de interés. -Resistencia a antibióticos/mismo gen: - Kanamicina (procariotas) - Neomicina (eucariotas) Knock-out Knock-in -Opcional: - Gen marcador - Gen de expresión. Transgénesis por recombinación homóloga

Recombinación homóloga GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Promotor p DNA M Gen marcador R Resistencia CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga

Recombinación homóloga GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga

Recombinación homóloga GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA Transgénesis por recombinación homóloga

MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

IN VIVO IN VITRO DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN. REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

ESPERMATOZOIDES Esponda, P. C.B.I. y C.S.I.C Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

Biolística o método de bombardeo. Modos de introducción del transgen

HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS Biolística o método de bombardeo. Partículas de tungsteno u oro Descarga con helio. Características: Capacidad de introducción limitada. HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

MICROINYECCIÓN Microinyección en el pronúcleo masculino. Microinyección en el citoplasma del huevo. Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.) Modos de introducción del transgen

¿Qué necesitamos para realizar la microinyección? Transgen Cigotos Introducir el transgén en el cigoto Desarrollar el embrión Construcción al azar. Animales donadores. Micromanipulador. Madres receptoras Modos de introducción del transgen

¿Como consigo los cigotos? Ovulación cíclica y corta (ratón, rata). Machos y hembras donadoras Hembras receptoras y machos vasectomizados Otras especies Tratamientos hormales en las hembras. Hembras donadoras y receptoras y machos.

Micromanipulador Modos de introducción del transgen

Micromanipulador Modos de introducción del transgen

Micromanipulador Modos de introducción del transgen

Pronúcleo masculino Modos de introducción del transgen

En animales domésticos (sobre todo en la especie porcina) es necesario centrifugar el huevo debido al vitelo. Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

Agrobacterium tumefaciens con gen de interes DNA de la planta Co-cultivo 48 horas 22ºC Formación de callos Aislamiento de posibles plantas transformadas DNA insertado en el genoma Pruebas genéticas que permitan controlar la inserción del gen Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

LIPOSOMAS CATIÓNICOS pH SENSIBLE O ANIÓNICO Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. pH SENSIBLE O ANIÓNICO Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”. Modos de introducción del transgen

MÉTODOS “IN VITRO” (Cultivos celulares) Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS FÍSICOS Modos de introducción del transgen

FOSFATO DE CALCIO Características: - Pequeña expresión del transgén. Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato). Introducción por endocitosis. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%) Características: - Pequeña expresión del transgén. - Introducción de varias copias. - No hay toxicidad para las células. Modos de introducción del transgen

IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS Electroporación FÍSICOS FÍSICOS Modos de introducción del transgen

ELECTROPORACIÓN - Mucha muerte celular Características: Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico. Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS. Características: - Mucha muerte celular - Tendencia a introducir una sola copia. Método de elección para la recombinación homóloga. Modos de introducción del transgen

¿Cómo consigo un animal adulto a partir de células en cultivo? Modos de introducción del transgen

DOS OPCIONES 1 2 Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos. 1 DOS OPCIONES Células transformadas en indiferenciadas: CLONACIÓN 2 Modos de introducción del transgen

Células ES o indiferenciadas SÓLO AISLADAS EN RATÓN Modos de introducción del transgen

Las células ES no se han aislado en otras especies animales NUMEROSOS INTENTOS PERO...... Las células ES no se han aislado en otras especies animales (Experiencias realizadas en peces) Modos de introducción del transgen

OTROS CULTIVOS CELULARES: Fibroblastos, Glándula mamaria, etc. Clonación de células somáticas Modos de introducción del transgen

DOLLY Modos de introducción del transgen

- Baja la transcripción. - Baja la traducción. DOLLY G0 : - Baja la transcripción. - Baja la traducción. - Condensación de la cromatina Modos de introducción del transgen

PRODUCCIÓN DE: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom 245 Polejaeva, I.A. y cols. (2000) Nature, 407, 86-90 5 72 Modos de introducción del transgen

Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en 1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones

Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en 1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones

Introducción del Gen LIS en levadura viníca linalol linasa Sintesis de linalol Asociado a los componente de aroma afrutado y floral Aplicaciones

Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en 1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones

Producción de proteínas recombinantes en organismos unicelulares Aplicaciones

Crecimiento secundario Purificación proteína Transformación Crecimiento secundario Purificación proteína Crecimiento a gran escala Salida al mercado

Biotecnología de corral - Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animales que nos interesan. - Producción de proteínas de interés en sanidad. Ejemplo (ya creado): Tracy (Roslin Institute - PPL Therapeutics) Aplicaciones

TRACY Promotor b-lactoglobulina as1-antitripsina humana ovina Aplicaciones

Primeros ensayos en ratón: 4.3 Kb Promotor WAP de ratón 6.6 Kb de AAT-humano cDNA Obtienen microlitros de leche 12.5 gr./litro Volumen/año gr./año Producción vital 8 litros 400 litros 10.000 l. 0.04 Kg. 2 kg. 50 kg 1 Kg. 100 kg. toneladas Coneja Oveja Vaca Aplicaciones

Anticuerpos humanizados Roslin Institute-PPL Therapeutics (lo que sabemos......) as1-antitripsina Fibrinógeno Factor VII y Proteína C Factor XI BSSL (lipasa) Anticuerpos humanizados Aplicaciones

POLLY: Primer clon transgénico Aplicaciones

Aplicaciones 2.-Producción de sustancias terapéuticas en 1. Cambio de características de organismos utilizados en la producción de alimentos 2.-Producción de sustancias terapéuticas en - Organismos unicelulares. - Biotecnología de corral. 3.Nuevos alimentos - Cambio cuantitativo - Cambio cualitativo Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cuantitativas - Muchos intentos realizados. - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos REINO VEGETAL Aplicaciones

LA REVOLUCIÓN AZUL!!!! Ejemplo (ya creado): Un Salmón (Aqua Bounty Farms): - Promotor: AFP (proteína anticongelación) - cDNA: Hormona del crecimiento. Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cualitativas - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Reino vegetal: la mayoría de los alimentos. Reino animal: Proyectos de creación. Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal Tolerancia a los herbicidas       54%  Resistencia a insectos (Bt)       37%  Resistencia vírica                 14%  Rasgos cualitativos               >1%  - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. - Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt. Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada. - Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor. - RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina) Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal Maíz Bt:Muchisima presion social. Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro). Aplicaciones

¿Qué es un alimento transgénico? Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt... - Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc. - Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante) - Animales tratados con proteínas recombinantes... - Animales alimentados con alimentos transgénicos Aplicaciones