CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS CARBOHIDRATOS MONO Y DISACÁRIDOS SOLUBILIDAD: MUY SOLUBLES EN AGUA MENOS SOLUBLES EN ETANOL ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON AGUA CALIENTE INSOLUBLES EN SOLVENTES ORGÁNICOS (EXCEPTO PIRIDINA)

IMPORTANCIA DE LA SOLUBILIDAD DE LOS CARBOHIDRATOS INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA REALIZAR DETERMINACIONES DE DENSIDAD. EXISTE RELACIÓN ENTRE SU DENSIDAD Y SU CONCENTRACIÓN

ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS MUY ÚTIL PARA DETERMINAR SU CONCENTRACIÓN. EXACTO SÓLO PARA SOLUCIONES DE PURA SACAROSA. AMPLIAMENTE USADO PARA APROXIMAR VALORES PARA OTRAS SOLUCIONES AZUCARADAS.

ROTACIÓN ÓPTICA DE LOS CARBOHIDRATOS FACILITA AL MÉTODO PARA MEDIR LA CONCENTRACIÓN DEL AZÚCAR EN SOLUCIÓN. MÉTODO BASADO EN MEDICIONES POLARIMÉTRICAS. GENERALMENTE UTILIZADO CON SACAROSA Y ALMIDÓN.

PROPIEDADES REDUCTORAS DEL GRUPO CETO O ALDEHÍDO EL GRUPO CETO O ALDEHÍDO REDUCIRÁN SOLUCIONES ALKALINAS DE SALES METÁLICAS AL METAL ÓXIDO O LIBRE. LA REACCIÓN ENTRE EL AZÚCAR Y EL SULFATO CÚPRICO NO ES ESTEQUIOMÉTRICA Y PROPORCIONA ÓXIDO CUPROSO MUY DEPENDIENTE DE LAS CONDICIONES DE LA REACCIÓN.

REACCIONES DE CONDENSACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS MONOSACÁRIDOS + ÁCIDO FUERTE + CALOR → SUBSTANCIAS QUE SE CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G. FENOL) PARA PROPORCIONAR COMPLEJOS COLOREADOS. PÉRDIDA DE AGUA Y FORMACIÓN DE DERIVADOS DEL FURFURAL. (SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL ÁCIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD DE CALENTAMIENTO)

REACCIONES DE SUSTITUCIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS FORMACIÓN DE ÉTER (E.G. METIL ÉTERES) ESTERIFICACIÓN (E.G. ACETATOS DE ALDITOL) IMPORTANTES EN LA PREPARACIÓN DE DERIVADOS VOLÁTILES PARA LA CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.

PROPIEDADES DE LOS POLISACÁRIDOS SOLUBILIDAD.- VARÍA ENORMEMENTE DEXTRINAS (ALMIDONES DE VARIAS COMPOSICIONES PARCIALMENTE HIDROLIZADOS) AMILOPECTINA Y GLUCÓGENO.- SE DISPERSAN PARCIALMENTE EN AGUA CALIENTE.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS SUBSTANCIAS PÉCTICAS.- SOLUBLES EN AGUA CALIENTE A MENOS QUE CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca. GOMAS, MUCÍLAGOS, ARABINOXILANOS, ß-GLUCANOS.- SOLUBLES EN AGUA

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y XILANOS, HEMICELULOSA.- INSOLUBLES EN AGUA. EN GENERAL LOS POLISACÁRIDOS SON INSOLUBLES EN ALCOHOLES ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA DE 75 A 80% (v/v).

FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE LOS POLISACÁRIDOS EL ALMIDÓN FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON EL YODO EN SOLUCIÓN DE NaCl/KI. LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DE LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO FORMAN COMPLEJOS CON LOS COMPUESTOS CUATERNARIOS DE AMONIO

HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS LA MAYORÍA DE LOS POLISACÁRIDOS SON SUJETOS A LA HIDRÓLISIS EN PRESENCIA DE ÁCIDOS DILUIDOS. LA MAYORÍA DE LOS COMPONENTES DE LA HIDRÓLISIS SON ESTABLES EN LOS ÁCIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA (SE NECESITAN 72% (p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA) LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO DE UN POLISACÁRIDO CONFIEREN ESTABILIDAD EN EL ENLACE GLUCOSÍDICO ADYACENTE.

SOLUBILIDAD DE LOS POLISACÁRIDOS LA MAYORÍA DE LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO SE LIBERAN EN COMBINACIÓN CON OTRO RESIDUO, PRODUCIENDO UN DISACÁRIDO EXTREMADAMENTE RESISTENTE A LA HIDRÓLISIS ÁCIDA.

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES LIBRES PREPARACIÓN DE LA MUESTRA CUANDO LOS AZÚCARES ESTÁN EN SOLUCIÓN GASES DISUELTOS.- REMUÉVANSE DE LOS PRODUCTOS CARBONATADOS O FERMENTADOS MEDIANTE VACÍO

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR CON LAS REACCIONES. EXISTEN MUCHAS MANERAS DE ELIMINARLOS (E.G. CARBÓN O SALES DE PLOMO) ACETATO DE PLOMO BÁSICO.- INTERFERIRÁ CON LOS MÉTODOS POLARIMÉTRICOS.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ACETATO DE PLOMO NEUTRO.- FORMA PREFERENTE DE USO. SE UTILIZA COMO UNA SOLUCIÓN ACUOSA SATURADA. SE ELIMINA EL EXCESO AÑADIENDO YA SEA OXALATO DE SODIO O POTASIO.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DESPROTEINIZACIÓN LAS PROTEÍNAS INTERFIEREN CON LAS DETERMINACIONES REDUCTORAS Y COLORIMÉTRICAS. EL USO DE TCA (ÁCIDO TRICLOROACÉTICO) ES DEMASIADO FUERTE PARA DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN SOLUCIÓN CONTIENE DISACÁRIDOS O FRUCTOSA.

DESPROTEINIZACIÓN DE LA MUESTRA MÉTODOS ACEPTABLES: AÑÁDASE ETANOL O ACETONA AL 70% (v/v). LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS COAGULARÁN Y SE PODRÁN FILTRAR O CENTRIFUGAR.

DESPROTEINIZACIÓN DE LA MUESTRA b) PRECIPITACIÓN CON METALES PESADOS BAJO CONDICIONES ALKALINAS. EJEMPLO: LA SOLUCIÓN CARREZ PRECIPITA PROTEÍNAS, ABSORBE ALGUNOS COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.

PROCEDIMIENTO SE AÑADE A LA MUESTRA LÍQUIDA SOLUCIÓN CARREZ I (HEXACIANOFERRATO DE POTASIO, K4[Fe(CN)6]·3H2O), SE AÑADE A LA MUESTRA SOLUCIÓN CARREZ II (SULFATO DE ZINC (ZnSO4·7 H2O), Y SOLUCIÓN DE NaOH. SE ENFRÍA, SE DILUYE A UN VOLUMEN DETERMINADO Y SE FILTRA.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UN EXTRACTOR SOXHLET SE AÑADE LA MUESTRA AL ETANOL AL 80% (v/v, CONCENTRACIÓN FINAL) HIRVIENDO. LOS POLISACÁRIDOS SON INSOLUBLES Y EL CALOR INACTIVA A LAS ENZIMAS.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR PUEDE AÑADIRSE CARBONATO DE CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS ÁCIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE ÉSTOS PUEDEN OCASIONAR LA HIDRÓLISIS DE LOS POLISACÁRIDOS. TAMBIÉN SE DEBE USAR EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN BUFFER PARA EVITAR LA HIDRÓLISIS ÁCIDA

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN DE AZÚCAR EN CASO DE QUE SE NECESITE ELIMINAR EL ETANOL DEL EXTRACTO PREVIO AL ANÁLISIS SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO MEDIANTE VACÍO. TAMBIÉN SE PUEDE REALIZAR CALENTANDO LEVEMENTE EN BAÑO MARÍA BAJO CAMPANA DE EXTRACCIÓN O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS MÉTODOS QUÍMICOS MÉTODO FLUORIMÉTRICO MÉTODOS ENZIMÁTICOS CROMATOGRAFÍA DE GASES CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA MÉTODOS FÍSICOS

MÉTODOS QUÍMICOS REACCIONES DEL H2SO4 Y CARBOHIDRATOS ÁCIDO FENOL SULFÚRICO FUNDAMENTO.- PROVIENE DE LOS PRODUCTOS DE REACCIÓN Y DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO Y EL AZÚCAR.

ÁCIDO FENOL SULFÚRICO EL AZÚCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O FURFURAL (F) LOS CUALES SON REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO LA ABSORBANCIA A 490nm H2SO4 CONC. FENOL + CARBOHIDRATO → AMARILLO – NARANJA CALOR

ÁCIDO FENOL SULFÚRICO H+ H+ POLISACÁRIDOS → MONOSACÁRIDOS → F + HMF ∆ ∆

VENTAJAS DEL MÉTODO ES SENCILLO ES RÁPIDO SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES DE AZÚCAR (E.G. 5μg) ESPECÍFICO PARA CARBOHIDRATOS. NO EXISTE INTERFERENCIA CON PROTEÍNAS

VENTAJAS DEL MÉTODO A MENUDO NO ES NECESARIA LA CLARIFICACIÓN DE LA MUESTRA LOS REACTIVOS SON BARATOS Y ESTABLES COLOR ESTABLE RESULTADOS REPRODUCIBLES RESULTADOS CONFIABLES

DESVENTAJAS DEL MÉTODO LOS CARBOHIDRATOS QUE NO PROPORCIONAN HMF Y F EN LA DESCOMPOSICIÓN ÁCIDA RESULTAN EN UNA AMPLIA GAMA DE COLORES. POR TANTO EL MÉTODO NO MIDE TODOS LOS CARBOHIDRATOS

DESVENTAJAS DEL MÉTODO MIDE LA MAYORÍA DE LOS CARBOHIDRATOS PERO LA INTENSIDAD DEL COLOR VARÍA AMPLIAMENTE ENTRE LOS CARBOHIDRATOS, POR LO QUE SE DEBE SELECCIONAR UNO DE ELLOS COMO REFERENCIA

DESVENTAJAS DEL MÉTODO LA PROPORCIÓN DE H2SO4 ES MUY IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA MUESTRA ACUOSA. SE DEBE EVITAR LA CONTAMINACIÓN PROVENIENTE DEL PAPEL FILTRO O POLVO DE CELULOSA

ANTRONA – ÁCIDO SULFÚRICO (9,10 DIHIDRO-9-OXOANTRACENO) FUNDAMENTO EL MÉTODO ES BÁSICAMENTE IGUAL AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE SE OBTIENE ES AZÚL – VERDE Y SE LEE A UNA ABSORBANCIA DE 620nm. TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS QUE EL MÉTODO ANTERIOR.

DETERMINACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES AZÚCAR + ÁLKALI → FRAGMENTOS DE AZÚCAR REDUCTOR + Cu(OH)2 ← COMPLEJO DE COBRE DE TARTRATO Y CITRATO ↓ ∆ OH H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE ÁCIDOS DE AZÚCAR

SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO DOS SOLUCIONES : SOLUCIÓN A: SULFATO DE COBRE CRISTALINO SOLUCIÓN B: TARTRATO DE SODIO Y POTASIO (O CITRATO DE SODIO) + HIDRÓXIDO DE SODIO (O HIDRÓXIDO DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)

SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA PRECIPITACIÓN DEL HIDRÓXIDO CÚPRICO EL ÁLKALI ENOLIZA A LOS AZÚCARES Y PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++ (CÚPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IÓN CUPROSO)

SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++ SE REDUCEN POR LOS FRAGMENTOS DE AZÚCAR, LOS IONES Cu+ SE COMBINAN CON LOS IONES HIDROXILO PARA FORMAR HIDRÓXIDO DE COBRE (DE COLOR AMARILLO, Cu+).

SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO EL CuOH REDUCIDO PIERDE H2O EN PRESENCIA DE CALOR PARA DAR COMO RESULTADO ÓXIDO CUPROSO INSOLUBLE (Cu2O)

SOLUCIÓN DE FEHLING FUNDAMENTO LA DETERMINACIÓN DEL COBRE REDUCIDO SE PUEDE LLEVAR A CABO POR GRAVIMETRÍA, VOLUMETRÍA, O POR MÉTODOS ELECTROLÍTICOS. EL PESO DEL Cu2O SÓLO ES APLICABLE A MUESTRAS RELATIVAMENTE PURAS.

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FEHLING LA REDUCCIÓN DEL COBRE Y LA OXIDACIÓN DE LOS AZÚCARES NO ES ESTEQUIOMÉTRICA . LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO CUPROSO VARÍA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO ÁLKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE CALENTAMIENTO Y LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES EN LA MUESTRA

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FEHLING LOS AZÚCARES DIFIEREN EN SU HABILIDAD PARA REDUCIR LA SOLUCIÓN CÚPRICA, POR TANTO, LA TITULACIÓN (O PESO O ABSORBANCIA) DEBEN SER CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y POSTERIORMENTE SE RECURRIRÁ A TABLAS PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR PRESENTE EN LA MUESTRA

MÉTODO DE MUNSON WALKER FUNDAMENTO NaOH + Cu++ + AZÚCAR REDUCTOR → Cu+ + AZÚCAR ∆ (Cu2O) OXIDADO LA DETERMINACIÓN DEL Cu2O PUEDE SER GRAVIMÉTRICA, PERO ES GENERALMENTE MEJOR TITULAR EL ÓXIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS SIGUIENTES MÉTODOS (SE LLEVAN MUCHO TIEMPO):

TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO EL Cu2O REACCIONA CON EL IÓN FÉRRICO (Fe+++) EL CUAL ES REDUCIDO AL IÓN FERROSO (Fe++). POSTERIORMENTE EL IÓN FERROSO ES TITULADO (+2 →+3) CON PERMANGANATO (+3, ROSA → +2, INCOLORO) 1) Cu2O + Fe2(SO4)3 → 2FeSO4 + CuSO4 + CuO

TITULACIÓN DEL PERMANGANATO DE POTASIO 2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 → 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O

TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON ÁCIDO NÍTRICO. POSTERIORMENTE SE HIERVE LA MUESTRA PARA ELIMINAR EL EXCESO DE HNO3 HNO3 Cu2O → Cu(NO3)2 ∆

TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADE UNA CANTIDAD CONOCIDA DE SOLUCIÓN DE KI 2I- + 2Cu++ → 2Cu+ + I2

TITULACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO SE TITULA EL I2 LIBERADO CON UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3) S2O3-2 I2 + I- → I3- → S4O6-2 + 3 I- (TRIIODURO) SE USA ALMIDÓN COMO INDICADOR: AZÚL → INCOLORO

DESVENTAJAS DEL MÉTODO NO SE PUEDE DISTINGUIR ENTRE LOS DIFERENTES AZÚCARES REDUCTORES. SE REQUIEREN MUESTRAS RELATIVAMENTE GRANDES (100 A 200mg DE GLUCOSA POR DETERMINACIÓN.

MÉTODO SOMOGY I-NELSON AZÚCAR REDUCTOR + Cu++ → Cu+ + AZÚCAR REDUCTOR

MÉTODO SOMOGY I-NELSON PROCEDIMIENTO: Reactivo de Somogyi Cu+2 Muestra (Azúcar reductor +) Calor Azúcar Oxidante + Cu+ (Cu2O) Cu+1red) Cu+2(oxi) AsMo (ox) AsMo (red) Es de un fuerte color azul Se lee la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estándar

Reactivos para el Método de Somogy i y Nelson para azúcares reductores Reactivo de Somogy i NaCO3 - Carbonato de sodio NaHCO3 – Bicarbonato de Sodio KaNaC4H4O6 – Tartrato de Sodio Potasio CuSO4·5H2O –Sulfato de Cobre Reactivo de Nelson (NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio Na2HAsO7·H2O – Arsenato de Sodio H2SO4 – Ácido Sulfúrico

MÉTODO FLUORIMÉTRICO FUNDAMENTO ESTE MÉTODO ES POSIBLE CUANDO LOS COMPUESTOS ABSORBEN RADIACIÓN A LONGITUD DE ONDA CORTA Y LUEGO EMITEN RADIACIÓN A UNA LONGITUD DE ONDA MÁS LARGA.

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR EL MÉTODO FLUORIMÉTRICO EXTRACCIÓN CON ISO-BUTIL METIL CETONA. REACCIÓN CON HIDRACIDA DE ÁCIDO p-HIDROXIBENZOICO ADICIÓN DE REACTIVO Y LECTURA A UNA EMISIÓN DE 470nm EXCITACIÓN A 454nm

MÉTODOS ENZIMÁTICOS INFORMACIÓN GENERAL REQUIEREN DE UN EXTRACTO NEUTRO O ÁCIDO LIBRE DE ALCOHOLES Y METALES PESADOS (NO SE PUEDEN USAR SALES DE PLOMO PARA CLARIFICAR LOS EXTRACTOS)

APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS ENZIMÁTICOS SON POSIBLES PARA UN GRAN NÚMERO DE CARBOHIDRATOS O COMPUESTOS RELACIONADOS: MONOSACÁRIDOS DISACÁRIDOS POLISACÁRIDOS ALOCHOLES Y POLIOLES ÁCIDOS

FUNDAMENTO GLUCOSA EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA: BUFFER, o – DIANISIDINA · 2HCl (CROMÓGENO REDUCIDO) CATALASA GLUCOSA OXIDASA

REACCIONES GLUCOSA OXIDASA H2O + O2 + GLUCOSA → LACTONA DE ÁCIDO D-GLUCÓNICO + H2O CATALASA H2O2 → H2O + ½ O2 O2 + CROMÓGENO INCOLORO, REDUCIDO → CROMÓGENO AZÚL OXIDADO

DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA DE SACAROSA/GLUCOSA LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA ES DETERMINADA ANTES Y DESPUÉS DE LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA ANTES DE LA INVERSIÓN A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO. EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH) LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES ESPECÍFICAMENTE OXIDADA POR EL NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON LA FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO.

REACCIONES HK GLUCOSA + ATP → G6P + ADP G6P-DH G6P + NADP+ → GLUCONATO-FOSFATO + NADPH + H+ EL NADPH FORMADO EN ESTA REACCIÓN ES ESTEQUIOMÉTRICO CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA Y SE MIDE MEDIANTE EL AUMENTO EN ABOSROBANCIA A 334, 340 Ó 365 nm.

INVERSIÓN ENZIMÁTICA. A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES HIDROLIZADA POR LA ENZIMA ß-FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A GLUCOSA Y FRUCTOSA: ß-FRUCTOSIDASA SACAROSA + H2O → GLUCOSA + FRUCTOSA EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE CONCENTRACIONES DE GLUCOSA ANTES Y DESPUÉS DE LA INVERSIÓN ENZIMÁTICA

CROMATOGRAFÍA DE GASES FUNDAMENTO LOS AZÚCARES SON COMPUESTOS POLIHIDROXI UNIDOS FUERTEMENTE POR HIDRÓGENO YA SEA A AGUA O A ELLOS MISMOS EN CRISTALES. POR TANTO, TIENEN PUNTOS DE FUSIÓN MUY ALTOS (200-300°C)

CROMATOGRAFÍA DE GASES FUNDAMENTO LOS AZÚCARES SE PUEDEN CONVERTIR EN DERIVADOS VOLÁTILES POR MÉTODOS DE UN PASO ANTES DE SER SUJETOS A ANÁLISIS POR CG. LOS MÁS CONVENIENTES PARECEN SER: ACETATOS DE ALDITOL, METIL ÉTERES, Y TRIMETISILIL ÉTERES.

CROMATOGRAFÍA DE GASES FUNDAMENTO LA ALTA TEMPERATURA PUEDE OCASIONAR LA DEGRADACIÓN TÉRMICA DE LOS AZÚCARES, PARTICULARMENTE LA PÉRDIDA DE AGUA PARA FORMAR DERIVADOS ANHIDRO. LOS TRIMEISILIL ÉTERES TIENEN LA VENTAJA DE LA COMBINACIÓN DE ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE PERMITEN LA DETERMINACIÓN POR CG DE OLIGOSACÁRIDOS DE HASTA 7 CARBONOS

CROMATOGRAFÍA DE GASES PROCEDIMIENTO SE PREPARAN DERIVADOS VOLÁTILES DE CARBOHIDRATOS SE INYECTAN EN LA COLUMNA CALIENTE DEL CG LOS DERIVADOS VOLÁTILES PASAN A DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVÉS DE LA COLUMNA CON UNA CORRIENTE LEVE DE GAS ACARREADOR

CROMATOGRAFÍA DE GASES PROCEDIMIENTO LOS COMPONENTES SEPARADOS ALCANZAN EL FINAL DE LA COLUMNA Y EL DETECTOR. LA SEÑAL GENERADA POR EL DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA DE LA CARTA REGISTRADORA A OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE LA SUBSTANCIA.

MÉTODOS FÍSICOS DENSIMETRÍA FUNDAMENTO LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO A UNA TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE LA SOLUCIÓN, PERO ESTE MÉTODO PROPORCIONA UNA APROXIMACIÓN A LA CANTIDAD DE AZÚCAR PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZÚCAR RELATIVAMENTE PURA

DETERMINACIÓN POR DENSITOMETRÍA EL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN ES UN HIGRÓMETRO (TAMBIÉN UTILIZADO PARA MEDIR SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES). SE HA DISEÑADO UN HIGRÓMETRO ESPECIAL PARA LEER EL % DE AZÚCAR DIRECTAMENTE A 20°C (GRADOS BRIX).

ÍNDICE DE REFRACCIÓN FUNDAMENTO EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA MEDIDA DE SU CONCENTRACIÓN. LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES AZÚCARES DE IGUAL CONCENTRACIÓN TIENEN APROXIMADAMENTE EL MISMO ÍNDICE DE REFRACCIÓN

ÍNDICE DE REFRACCIÓN PROCEDIMIENTO SE DETERMINA EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LA SOLUCIÓN AZUCARADA A 20°C MEDIANTE UN REFRACTÓMETRO ABBÉ O UN REFRACTÓMETRO MANUAL. SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL % DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES (COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE ÍNDICES DE REFRACCIÓN A % DE SACAROSA COMO FACTORES DE CORRECCIÓN.

POLARIMETRÍA FUNDAMENTO LA RADIACIÓN SE COMPORTA COMO SI TUVIERA UN COMPONENTE ELÉCTRICO Y UNO MAGNÉTICO. ACTÚAN COMO SI ESTUVIERAN DISPUESTOS EN ÁNGULOS RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO. HAY MILLONES DE RAYOS QUE PROVIENEN DE LA FUENTE LUMINOSA. LA DIRECCIÓN DE LOS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS ES PURAMENTE ALEATORIA, ASÍ QUE SE TIENE RADIACIÓN NO POLARIZADA.

POLARIMETRÍA FUNDAMENTO SI SE PUEDE HACER QUE TODOS LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS SUS COMPONENTES ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS EN LA MISMA DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN SERÁ POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL USO DE UN FILTRO POLARIZADOR.

POLARIMETRÍA FUNDAMENTO CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA EN UNA MOLÉCULA ASIMÉTRICA (UN COMPUESTO QUE NO PUEDE PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO). LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES LLAMADO “COMPUESTO ÓPTICAMENTE ACTIVO” (e.g. GLUCOSA). SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA LUZ POLARIZADA NO SERÁ AFECTADA.

POLARIMETRÍA FUNDAMENTO EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO MANUALMENTE PARA COMPAGINAR VISUALMENTE LOS MATICES DE UN COLOR. ESTO ROTA AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE REGRESO A SU POSICIÓN ORIGINAL. SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN REQUERIDO.

MAGNITUD DE LA ROTACIÓN DEPENDIENTE DE: LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ UTILIZADA. LONGITUD DE LA CELDA NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA ACTIVA Y SU CONCENTRACIÓN TEMPERATURA

POLARÍMETROS vs SACARÍMETROS POLARÍMETRO: USA LUZ MONOCROMÁTICA Y LEE EN GRADOS ANGULARES (SE DEBE RELACIONAR CON LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR). SACARÍMETRO: USA LUZ BLANCA Y LEE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR DIRECTA.

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS MÉTODOS SE UTILIZAN ESTOS MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE ALIMENTOS O INGREDIENTES DE LOS MISMOS. PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA DE UN ALIMENTO PARA POSTERIOR ESTUDIO EN EL LABORATORIO.

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS FUNDAMENTO GENERAL LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EXPLOTAN LAS DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS EN LA SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU TAMAÑO, CARGA, CARACTERÍSTICAS DE ADSORCIÓN, AFINIDAD BIOLÓGICA POR OTRAS MOLÉCULAS. LAS TÉCNICAS SE UTILIZAN PARA PURIFICAR PROTEÍNAS INDIVIDUALES A PARTIR DE MEZCLAS COMPLEJAS.

CONSIDERACIONES GENERALES ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS PARA SU PURIFICACIÓN SE DEBE CONOCER: SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO ISOELÉCTRICO, SUS PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE DESNATURALIZACIÓN, ALGUNA CARACTERÍSTICA QUE LA DISTINGA DE LAS DEMÁS PROTEÍNAS.

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS LOS MÁS COMÚNES SON: PRECIPITACIÓN CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO

SEPARACIÓN POR CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD DIFERENCIAL FUNDAMENTO LA SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN. LAS PROTEÍNAS SON POLIELECTROLITOS Y SUS CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD ESTÁN DETERMINADAS POR EL TIPO Y CARGA DE AMINO ÁCIDOS EN LA MOLÉCULA.

PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE LAS PROTEÍNAS CAMBIANDO EL pH DEL BUFFER FUERZA IÓNICA CONSTANTE DIELÉCTRICA TEMPERATURA

PROCEDIMIENTOS SALADO (SALTING OUT) LAS PROTEÍNAS TIENEN PERFILES DE SOLUBILIDAD ÚNICOS EN SOLUCIONES DE SAL NEUTRAS. LAS BAJAS CONCENTRACIONES DE SALES NEUTRAS AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS.

SALADO (SALTING OUT) FUNDAMENTO SI SE AUMENTA LA FUERZA IÓNICA DE LA SOLUCIÓN LAS PROTEÍNAS SE PRECIPITAN. ESTE ES UNO DE LOS PRIMEROS PASOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS. ÉSTAS SE PUEDEN SEPARAR DE UNA MEZCLA MUY COMPLEJA CON ESTE MÉTODO.

SALADO (SALTING OUT) REACTIVOS SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4]. SE USA COMÚNMENTE DEBIDO A QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE. TAMBIÉN SE PUEDEN USAR: NaCl, O KCl.

PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA FUNDAMENTO PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). DEFINIDO COMO EL pH AL QUE UNA PROTEÍNA NO TIENE CARGA NETA EN SOLUCIÓN. LAS PROTEÍNAS SE AGREGAN Y PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE NO EXISTE REPULSIÓN ELECTROSTÁTICA ENTRE MOLÉCULAS.

PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA FUNDAMENTO LAS PROTEÍNAS TIENEN DIFERENTES pI’S, POR TANTO, PUEDEN SER SEPARADAS AJUSTANDO EL pH DE LA SOLUCIÓN. CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA SOLUCIÓN AL pI DE UNA PROTEÍNA ÉSTA PRECIPITA. SI LAS DEMÁS PROTEÍNAS TIENEN OTROS pI’S ÉSTAS PERMANECERÁN EN SOLUCIÓN

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR TAMAÑO FUNDAMENTO LOS PESOS MOLECULARES DE LAS PROTEÍNAS SON DE 10 000 A MÁS DE 1 000 000. POR TANTO, EL TAMAÑO ES UN PARÁMETRO A EXPLOTAR PARA SU SEPARACIÓN. LA SEPARACIÓN REAL OCURRE BASADA EN EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL ES EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTEÍNA EN SOLUCIÓN Y ES DETERMINADO POR LA CONFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA.

LEY DE STOKES Es la fuerza de fricción experimentada por objetos esféricos moviéndose en el seno de un fluido viscoso. La velocidad de los movimientos de dichos objetos es baja.

PROCEDIMIENTOS DIÁLISIS FUNDAMENTO SE UTILIZA PARA SEPARAR MOLÉCULAS EN SOLUCIÓN MEDIANTE EL USO DE MEMBRANAS SEMIPERMEABLES QUE PERMITEN EL PASO DE PEQUEÑAS MOLÉCULAS PERO NO DE LAS GRANDES.

DIÁLISIS PROCEDIMIENTO LA SOLUCIÓN PROTÉICA ES COLOCADA EN UN TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS QUE SE AMARRA O SUJETA POR UN EXTREMO. EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA VEZ QUE SE HA COLOCADO LA MUESTRA Y SE COLOCA EL TUBO O BOLSA EN UN GRAN VOLUMEN DE AGUA O BUFFER (GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MÁS GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN EL TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS).

DIÁLISIS FUNDAMENTO LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DIÁLISIS. EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA ADENTRO DEL TUBO. LA SOLUCIÓN PROTÉICA DE ADENTRO DEL TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA DIÁLISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA OSMÓTICA ENTRE LA SOLUCIÓN Y EL AGUA O BUFFER DE LA DIÁLISIS

APLICACIONES DEL MÉTODO DE DIÁLISIS SE PUEDE UTILIZAR ESTE MÉTODO PARA CONCENTRAR PROTEÍNA ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DIÁLISIS CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA SOLUCIÓN DENTRO DE LA BOLSA DE DIÁLISIS. EL EQUILIBRIO DE LA DIÁLISIS SE PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA ESTEQUIOMETRÍA DE LA UNIÓN PROTEÍNA-LIGANDO.

GELIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS CASO DE LA CASEÍNA DE LA LECHE FUNDAMENTO EL QUESO ES LA CUAJADA DE LA LECHE, BÁSICAMENTE UN GEL DE CASEÍNA .

FORMACIÓN DE LA CUAJADA SE BASA EN LA ACIDIFICACIÓN DE LA LECHE MEDIANTE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS. LAS ENZIMAS ACTÚAN EN UN RANGO ÓPTIMO DE 36-39ºC. SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA DE QUIMOSINA Y PEPSINA DE CERDO CON UNA ENZIMA COAGULADORA OBTENIDA DE UN HONGO.

FORMACIÓN DE LA CUAJADA LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO EN LA CONVERSIÓN DE LAS MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE CALCIO DISPERSAS EN FORMA COLOIDAL EN EL QUESO. LAS MICELAS DE CASEÍNA EN LA LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE POR LA ENZIMA QUIMOSINA. ÉSTA ES EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIÓN DE LA LECHE. CAUSA LA DIVISIÓN DE UN ENLACE ESPECÍFICO, EL ENLACE PEPTÍDICO DE FENIL-ALANINA-METIONINA. ROMPE LA PORCIÓN ÁCIDA RICA EN CARBOHIDRATOS DE LA MOLÉCULA DEL RESTO HIDROFÓBICO PRIMARIO O para-k- CASEÍNA.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO CON LA PÉRDIDA DE LA PORCIÓN ÁCIDA DE LA MOLÉCULA, EL RESTO DE LA k-CASEÍNA YA NO ESTABILIZA LAS MICELAS. ÉSTAS SE APROXIMAN UNAS A OTRAS Y SE UNEN, PROBABLEMENTE POR ENLACES HIDROFÓBICOS Y FORMAN UNA RED TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA FASE ACUOSA DE LA LECHE.

EFECTOS DE LA QUIMOSINA EN LA FORMACIÓN DEL QUESO LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL CALCIO DE LA MICELA. EL COAGULO DE LA LECHE FORMADO POR LA ACCIÓN DEL CUAJO ES EL FOSOFOCASEINATO DE CALCIO. EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES FIRME, ELÁSTICO.

TEMPERATURA ÓPTIMA DE FORMACIÓN DE LA CUAJADA LA LECHE NO DEBE SOBRECALENTARSE ANTES DE AÑADIR EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA GEL ÉSTE SERÁ DÉBIL DEBIDO, EN PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO POR EL CALOR ENTRE LA β-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASEÍNA. ÉSTA ÚLTIMA SE HACE RESISTENTE AL EFECTO DE LA QUIMOSINA.