Biomarcadores en Suero Candidatos para Adenocarcinoma en Próstata Identificados por Diferencias del ARNm en Tejido Prostático y Verificados con Mediciones de Proteínas en Tejido y Sangre E.W. Klee, O.P. Bondar, M.K. Goodmanson, R.B. Dyer, S. Erdogan, E.J. Bergstralh, H.R. Bergen III, T.J. Sebo y G.G. Klee Marzo 2012 www.clinchem.org/content/article/58/3/599.full © Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry

Antecedentes Se necesitan pruebas mejoradas para la detección y manejo de cáncer de próstata Se plantea la hipótesis de que: La expresión genética diferencial en tejido prostático podría ayudar a identificar biomarcadores en sangre candidatos para cáncer de próstata Podría utilizarse la sangre de varones con enfermedad prostática avanzada para verificar la presencia de biomarcadores en la circulación

Métodos Marcadores candidatos identificados usando patrones de expresión de ARNm de tejido prostático microdiseccionado capturado por laser Expresión del tejido confirmada usando inmunohistoquímica (IHC) para el subconjunto de candidatos que tienen antisuero comercial Extractos de tejido analizado con espectrometría de masa en tandem (MS/MS) Concentraciones de sangre medidas usando: Inmunoensayos MS/MS de tripsina asimilada, péptidos inmunoestractados

Diseño del Estudio Figura 1. Procesos usados para identificar nuevos biomarcadores candidatos y medir proteínas en tejido y sangre. LCM, Microdisección capturada por laser. Búsqueda con MS/MS para estos biomarcadores previstos en extractos de tejido PCa 5 biomarcadores Medición de expresiones de ARNm en tejido LCM PCa Uso de bioinformática para predecir biomarcadores secretados 35 nuevos candidatos Péptidos sintetizados e isótopos estables Hacer antisuero anti- péptido de conejo Uso de bioinformática para predecir la asimilación de péptidos de tripsina para estos biomarcadores 24 biomarcadores ¿Antisuero IHC Disponible? Inmunohistoquímica de tejido normal y con PCa 13 biomarcadores Si ¿Biomarcador Glicosilado? No Si Extracción del suero con concanavalina A 7 biomarcadores ¿ELISA disponible? ELISA de suero PCa y controles 8 biomarcadores Si No Albúmina agotada y proteínas abundantes del suero No Asimilación de tripsina de extractos de suero Fin 11 biomarcadores diferentes Asimilación de tripsina Concentrado usando antisuero antipéptido 11 biomarcadores MS/MS dirigido a la medición de péptidos

Evaluación de Proteína en Tejido Inmunohistoquímica Muestras Tejido FFPE (N=20 pares) 10 muestras, Gleason 5 o 6 10 muestras, Gleason 8 o 9 Muestras de tumor han empatado con tejido benigno adyacente QTOF MS Muestras Tejido PCa Congelado (N=2 pares) Gleason 9, T3aN0+ tumor Gleason 7, T3aN0-

Análisis MS/MS de Extractos de Tejido Muestras por electroforesis en gel de SDS-PAGE y proteínas asimiladas in-situ. Identificación de Péptido por espectrometría de masas usando Espectrómetro de Masas Híbrido LTQ Orbitrap Resultados: Se identificaron 5 marcadores candidatos, 3 con concentración elevada en muestras de tumor: ASPN PGLS RPL22L1 Prostate= Próstata Control= Control Protein= Proteína

Tabla 1. Inmunohistoquímica (13 marcadores). C, tejido de cáncer de próstata; N, tejido normal adyacente; 0, sin tinción; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, tinción fuerte. P-valores de prueba de signo de una cola.

Ensayos de Proteína en Suero Los inmunoensayos estaban disponibles MS/MS Extracción de Glicoproteínas con Lectinas Tripsina Digerida y Péptidos inmuno extracto Muestras: Alícuotas congeladas de suero y EDTA Casos: 50 varones con cáncer de próstata avanzado Controles: 26 varones con biopsias recientes de próstata 13 PCa libre de cáncer 13 con PCa en bajo grado

Resultados de Inmunoensayo Biomarcador Vendedor Resultados APO-C1 AssayPro 8/50 ** C4A Assay Design 4/50 CCL19 R&D Systems 2/50 COMP Immuno-Biology 0/50 CXCL11 7/50 ** CCXL14 CXCL9 13/50 ** Factor V Aniara ** Rango Significativo de Sumatoria de Prueba cuando se compara con suero de cáncer de próstata avanzado y suero control (P < 0.05)

49 Péptidos sintetizados representando a 25 biomarcadores Método de Ensayo de Suero MS/MS (Baja Abundancia) 49 Péptidos sintetizados representando a 25 biomarcadores Conejos inmunizados con anticuerpos para péptidos Péptidos extraídos como objetivo Primeras proteínas de alta abundancia agotadas Después sangre asimilada para hacer péptidos Finalmente uso de anticuerpos de conejo para extraer péptidos. Péptidos medidos usando Espectrometría de Masas (MS/MS)

Fraccionamiento del suero antes del MS/MS Extracción de Concanavalina-A 1 mL de Suero Merma de Proteína Mars-14, alta abundancia de proteínas en 1mL de suero agotado Fracción de elusión Fluye a través Asimilación de Tripsina Asimilación de tripsina Arreglo A de Anticuerpos afines COL2A1:871 PCDHGA4:265 CHD7:142 PCDHB10_72 APOF:232 Arreglo C de Anticuerpos afines COL9A2:198 OGDHL:673 ALDH3B2:121 PCSK6:597 PGLS:214 RPL22L1:15 COMP:485 Elude   Agregar estándares Isotópicos y cuantitativos en MS/MS Elude Fluye a través elusión Arreglo B de Anticuerpos afines OGDHL:673 ASPN:153 F5:2151 B3GNT1:162 PCSK6:597 Elude

Resultados del Ensayo MS/MS Biomarcador Afinidad de Col MS/MS Resultados APOF A 2/50 ASPN B 26/50 ** C1orf64 0/50 CDH7 11/50 COL2A1 5/50 Factor V 23/50 ** PCSK6 B,C 8/50, 4/50 ** PGLS C 7/50 RPL22L1 ** Rango significativo de la suma de pruebas (P < 0.05) para la separación de cáncer avanzado de otros grupos

Trazos de mediciones secuenciales para el Arreglo A para A) ELISA y B) MS/MS Sequence analysis order= Orden de secuencia de análisis Analysisi order on..=Orden de análisis en… Analysisi sequence order: Orden de análisis secuenciado

Trazos de mediciones secuenciales para Arreglo en cadena de MS/MS B y C

Conclusiones Se identificaron 7 nuevos biomarcadores estadísticamente significativos en la discriminación de concentraciones de proteína en sangre de varones con cáncer de próstata comparados con los controles: APOC1, ASPN, COMP, CXCL11, CXCL9, F5, y PCSK6 Se identificaron adicionalmente 4 nuevos biomarcadores con concentraciones elevadas en suero en al menos el 10% de muestras de cáncer de próstata avanzado comparadas con los controles: CDH7, COL2A1, PGLS y RPL22L1

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