1 Tutorial de Uso Metamorph. Como optimizar el análisis de Z series: Deconvolución 2D + Proyección másiva(fusión de planos) Unidad de Microscopia

2 DECONVOLUCION 2D: La aplicación”DECONVOLUCIÓN 2D” permite limpiar la imagen,logrando una imagen mucho MÁS limpia y nítida que la original al eliminar fondo e imperfecciones. Puede aplicarse a una imagen aislada o a todos los cortes de una serie Z como se muestra en la captura anexa (anexo a Source image se nos permite elegir un único plano o todos los planos de la serie Z a deconvolucionar) Hay 2 modos de deconvolución : 1-Neighbors: MODO PREFERENTE: realiza la deconvolución entre “pixeles vecinos” con lo cual se logra una mayor calidad de imagen al considerar pixeles contiguos en el tratamiento de imagen. 2-No Neighbors: no aplica deconvolución a pixeles contiguos, menor calidad. Para aplicar la deconvolucion 2d es necesario SIEMPRE conocer los 3 parámetros de captura: -apertura numérica -índice de refracción -longitud de emisión.

3 ¿Cómo optimizar la Deconvolución 2d? Para aplicar deconvolución 2d es preferible seleccionar el modo NEAREST NEIGHBOURS Abriendo la aplicación accedemos a la ventana de control con 2 pestañas: 1.-MAIN : que no necesita ser modificada. 2.-SETTINGS : que siempre debemos configurar para cada deconvolución a realizar. Paso previo : Lo primero que debemos hacer es cargar la serie o imagen a tratar en SOURCE IMAGE y seleccionar en el icono anexo si aplicaremos la deconvolución a todos los planos de la muestra o sólo al seleccionado en pantalla.

4 Pestaña Settings: En la pestaña “settings” debemos introducir siempre los 3 parámetros con los que ha sido capturada la muestra para optimizar la deconvolución, estos 3 parámetros son: Apertura numérica Indice de refracción Longitud de EMISION** Sólo introduciendo estos 3 parámetros se pueden optimizar los resultados. **Muy importante: Se debe introducir siempre la longitud de EMISION del fluorocromo y no la de excitación. -Clicando en APPLY obtenemos la nueva serie deconvolucionada sobre la que podemos aplicar “fusión masiva” para optimizar la visión de la muestra.

5 Nota: Si no recordamos las condiciones de captura podemos revisarlas en : EDIT>>IMAGE INFO ó EDIT>>IMAGE PROPERTIES En ambas opciones se muestran los valores de : -apertura numérica, -índice de refracción y -longitud de emisión Recordar que siempre tenemos que optimizar la deconvolución con la longitud de EMISION (no excitación).

6 Fusión masiva: Una vez obtenida la serie de planos Z deconvolucionada puede ser útil la fusión de todos los planos en uno único para la visualización de estructuras. Para la fusión masiva de planos aplicamos la función preferente: STACK>>3D Reconstruction Accedemos a la ventana de control donde sólo debemos seleccionar la modalidad de fusión de planos en RECONSTRUCTION TYPE Los modos de fusión preferentes son : -maximum (máximo) -self luminous pixels (pixeles luminosos)

7 La fusión masiva permite la unión de todos los planos de una serie Z en una única imagen que permita optimizar la visualización de las estructuras de la captura. En este caso se muestran los resultados obtenidos para la fusión de planos de una serie deconvolucionada en modo: (1)-pixeles luminosos (2)-máximo 1-fusión masiva por pixeles luminosos 2-fusión masiva por maximo

8 Resumen: Podemos optimizar el análisis de una serie Z aplicando Deconvolución 2d y posterior fusión masiva de planos. 1: Visor galería que incluye la secuencia de planos capturados en la Serie Z(o timelapse). 2:Secuencia de planos deconvolucionada: Process>Deconvolucion 2d>>Modo nearest neighbours. Importante: Es Necesario conocer e introducir los 3 parámetros de captura : Apertura numérica Indice de refracción Longitud de emisión. 3:Fusión masiva: aplicación de la fusión de todos los planos Z deconvolucionados: Stack>>3D Reconstruccion. Usamos 2 modos de fusión preferente: -Máxima -Píxeles luminosos 1 2 3

9 Unidad de Microscopía Centro de Investigación del Cáncer Campus Miguel de Unamuno Salamanca (Spain).