Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé
Objetivos
-Biotecnología -Subcloning -Vectores -3 Modulos 1)Ligación : fragmento + vector 2)Transformacion de E coli 3)Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes 4)Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido El Vector: pUC8, 2700pb Sitio para Eco R1 en M13 mp en el fragmento de LacZ
pUC8 – 2665 bp Contiene parte del gen lac Z Codifica para ß galactosidasa Metabolismo de galactosidos Operon de lactosa α fragment del gene de lacZ
-E coli mutada en lac Z -Su cromosoma tiene el fragmento Ω de lac Z -Cuando α y Ω interactuen lac Z sera funcional -α complementation -Operon de lac -Represores (lac) -Activadores (CAP+ cAMP) -Inductores (IPTG) atrapan al represor -Sustratos para ß galactosidasa -Lactosa -X-Gal, hidrolizado se pone azul -PLT transformantes con pUC donde lacZ sea funcional seran azules! -ONPG – sustrato para ßgal pero amarillo espectrofoto
MCR/MCS MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiere Insertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z gene PLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas
Ligacion: Vector linearizado T4 DNA ligasa Fragmentos de DNA Mg+2 Enlace fosfodiester 5’-3’ 37 C vs 4-22 C
Recircularizacion Concatamerizacion Alk Phosph Orientacion de la ligacion Transformacion Celulas competentes (JM109) -No resistencia -No plasmids -No enzimas de restriccion
Eficiencia de la transformacion -supercoiled > circular > lineal 10 ngs es suficiente 100 ngs inhibe 1/10000 celulas se transforma Se define 3 de transformantes por µg de DNA 10 ng para 1ml de celulas Salen 100 colonias = 1000 transformantes/ml 1000transf/0.01ug = 1x10^5 Screening Blue/White -Resistencia ayuda a seleccionar (Amp) -Pero de las que crecen cuantas tienen el gen? -Azules vs Blancas - Azules lacZ+ ONPG amarillo -Blancas lacZ- ONPG no
Study Questions
Resultados Recuerde discutir los resultados objetivo por objetivo. Cada objetivo tiene una pregunta de investigación, una hipótesis, alguna tabla o figura que los resume y su discusión y conclusión. Al final una conclusión general de todo el ejercicio.