Los Vectores de Clonaje

Mapa de Restricción de pUC18 y pUC19 ( se diferencian la secuencia de MCS ) Los pUC son vectores típicos de Clonaje. Vemos que su tamaño es de 2686 bp Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

MCS Multi Cloning Site Ampicilin Resistencia Ori C Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Hind III Sph I Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I Kpn I Sac I EcoR I pUC18 MCS 5´ 396 3´ 455 GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC Hind III Sph I Pst I Sal I Xba I BamH I Sma I Kpn I Sac I EcoR I Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Supongamos que preparamos el vector para insertar un fragmento de DNA que tiene extremos Hind III y BamH I Hind III BamH I AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAG ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAG GCCA GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC CGGTTCGA GGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC CGGTTCGAACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG GCCA AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC CGGTTCGA ACGTACGGACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGGGGCCCATGGCTCGAGCTTAAG Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Estamos linearizando el vector MCS Multi Cloning Site Estamos linearizando el vector CCGGG GGCCCCTAG AGCTTG AC Hind III BamH I Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Ahora podemos unir Vector e inserto si ambos fueron digeridos con los mismos enzimas Hind III BamH I AGCTTG AC CCGGG GGCCCCTAG VECTOR LINEARIZADO Hind III BamH I AGCTTG AC CCGGG GGCCCCTAG INSERTO DIGERIDO CON Hind III y BamH I Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

+ LIGACIÓN VECTOR LINEARIZADO INSERTO Ori C INSERTO Ampicilin AGCTTG AC CCGGG GGCCCCTAG + VECTOR LINEARIZADO AGCTTG AC CCGGG GGCCCCTAG INSERTO LIGACIÓN INSERTO Ampicilin Resistencia Ori C Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Las Bacterias se transforman con el vector conteniendo el inserto Vector con inserto Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Al añadir el antibiótico solo resistirán y crecerán las bacterias antibiótico-resistentes, que tienen el vector con el gen de resistencia. A esto se le denomina selección. ampicilina Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Una vez crecidas las bacterias, se lisan y se recoge el vector. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto Ahora tenemos “amplificado” el vector con el inserto. Tenemos un gran número de copias del inserto. Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Al digerir con los enzimas de restricción adecuados ( Hind III y BamH I ) el vector, se libera un gran número de copias del inserto clonado. HindIII BamH I AGCTTG AC CCGGG GGCCCCTAG Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Características de un vector de Clonaje Realizado por Dr. A. Martínez-Conde & Dra P. Mayor Dep. Bioquímica y Biología Molecular Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid