ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Rocio Inga Peña Dpto. Bioquímica, Biol Mol & Farmacología

Modificaciones: Glicosilación, fosforilación, adición de grupos prostéticos, etc…

Extracto crudo (mezcla de proteínas)

Gel de apilamiento (menor concentración) Gel de separación (la concentración depende de la resolución que se busque )

Marcadores de Peso Molecular

DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA Inicio de corrida (donde inicia el gel separador) Frente de corrida (línea donde termina el colorante)

DETERMINACION DEL TAMAÑO DE UNA PROTEINA PROBLEMA (RF) RF = distancia recorrida por la banda distancia total al frente de la corrida

REACTIVOS: Acrilamida (C3H5NO) – formación de polímeros Bisacrilamida (N,N’- methylenebisacrylamide (C7H10N2O2) - cross-linking entre las cadenas de polímeros SDS : saturación con cargas negativas APS y TEMED : catalizadores de la reacción de polimerización DTT o βME : agentes denaturantes Azul de Bromofenol: Permite la visualización de la corrida electroforética. Carga negativa por encima de pH 4.6.

Tinción del Gel SDS-PAGE La tinción con Azul de Coomassie ( Coomassie Brilliant Blue) puede detectar una banda de hasta 50 ng La tinción con plata incrementa la sensibilidad de detección ( 50 veces aprox)

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Separación por: Punto isoeléctrico Tamaño

Separación por Punto Isoeléctrico

Punto isoelectrico igual pero diferente tamaño Punto isoelectrico diferente pero del mismo tamaño

Análisis de Proteínas Multiméricas - Se puede determinar el número y tamaño de subunidades mediante la electroforesis bajo condiciones denaturantes Agentes denaturantes frecuentemente usados: Dithiotreitol (DTT) - β-mercaptoetanol (βME)

El Dithiothreitol (DTT) es un agente denaturante

PRACTICA A REALIZAR ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN UNA DIMENSION CONDICIONES: DENATURANTES (SDS, BME, alta temperatura)

Las muestras para analizar serán diferentes fracciones obtenidas durante la purificación de la Pirazinamidasa: Extracto crudo Fracción con proteìna, sin actividad Fracción con proteìna, con actividad

Dos tipos de tratamiento de muestras: A) Denaturación directa de las muestras: Mezclar 25 uL de la fracción + 15 uL de Loading Buffer (Buffer de carga) Hervir por 4 - 5 minutos Cargar 20-25 uL en el gel. B) Precipitación previa a denaturación - Se utilizará el protocolo de precipitación con Etanol (33%)

Actividad enzimática Cantidad de Proteína (Pirazinamidasa) (Bradford)