LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 1. Los requerimientos nutritivos de los microorganismos 2. Medios de cultivo: composición y preparación 3. Aislamiento de cultivos puros de microorganismos 4. Mantenimiento y conservación de microorganismos 5. Cultivos tipo y colecciones de cultivo 6. Definición del crecimiento 7. Curva de crecimiento 8. Métodos para medir el crecimiento microbiano 9. Crecimiento continuo 10. Factores que influyen en el crecimiento microbiano

LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 1. Los requerimientos nutritivos de los microorganismos 1.1 Macronutrientes 1.2 Oligoelementos 1.3 Factores de crecimiento

Monómeros Macromoléculas Estructuras celulares La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares. Monómeros Macromoléculas Estructuras celulares Monosacáridos Aminoácidos Ácidos grasos Bases nitrogenadas Polisacáridos Proteínas Lípidos Ácidos nucleicos Pared celular Glicocàlix Membrana Ribosomas Flagelo Pelos y fimbrias Enzimas Membranas Cromosoma Plásmidos

C Nutrición microbiana macronutrientes Elemento más abundante en las macromoléculas. Constituye el 50% del peso seco de las células. Muchos procariotas son heterótrofos. Necesitan algún tipo de compuesto orgánico como fuente de carbono para hacer nuevo material celular. Los aminoácidos, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los azúcares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromáticos y un sinfín de compuestos orgánicos de otro tipo pueden ser utilizados por las bacterias. Algunos procariotas son autótrofos, capaces de construir todas sus estructuras orgánicas a partir del CO2 con la energía obtenida de la luz o de compuestos inorgánicos. C macronutrientes

N Nutrición microbiana macronutrientes En una bacteria típica, alrededor del 12% de su peso seco es N. Forma parte de las proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares. En la naturaleza, se encuentra en forma orgánica e inorgánica. Pero la mayor parte del N natural se encuentra en forma inorgánica ( NH3, NO3- o N2 ). La mayoría de las bacterias son capaces de utilizar NH3 como única fuente de N, y otras muchas pueden utilizar NO3- . El N2 puede ser usado como fuente de nitrógeno por algunas bacterias, las bacterias fijadoras de nitrógeno.   N macronutrientes

Nutrición microbiana macronutrientes P S K Mg Ca Na El P se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e inorgánicos. La célula necesita P para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos. El S es un componente de los aminoácidos cis y met y se encuentra en algunas vitaminas, como tiamina, biotina, ácido lipoico y Coenzima A. La mayoría del S celular procede de fuentes inorgánicas, ya sean sulfatos o sulfuros. El K es necesario para todos los organismos. Es cofactor de muchas enzimas. El Mg funciona como estabilizador de los ribosomas, las membranas celulares y los ácidos nucleicos. También se necesita para la actividad de muchas enzimas. El Ca ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene una función importante en la termorresistencia de las endoesporas. El Na es requerido por algunos microorganismos (halófilos), P S K Mg Ca Na

Fe Nutrición microbiana El Fe es fundamental en la respiración celular. Forma parte de los citocromos y de proteínas que contienen Fe y S implicados en el transporte de electrones. En condiciones anaeróbicas, el Fe se encuentra en el estado de oxidación +2 (Fe+2) y es soluble. En condiciones aeróbicas suele estar en el estado de oxidación +3 ( Fe+3) y forma varios minerales insolubles. Para obtener el Fe de tales minerales, las células producen agentes quelantes llamados sideróforos que solubilizan el Fe y lo introducen en la célula. Es necesario en mayores cantidades que otros metales y no se considera un elemento traza. Nutrición microbiana Fe

Nutrición microbiana Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn Micronutrientes (elementos traza) Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn Se requieren en muy pequeñas cantidades. Son tan importantes para el funcionamiento celular como los macronutrientes. Muchos son metales que actúan como cofactores de enzimas. A menudo no es necesario añadirlos a los medios de cultivo. Si el agua utilizada para elaborar el medio es ultrapura se añade al medio una pequeña cantidad de una solución de metales traza.  

Nutrición microbiana tiamina (vitamina B1) biotina, Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que se necesitan en muy pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento son vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. La mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, pero en algunos casos es necesario añadirlos al medio. Las vitaminas son los factores de crecimiento que se necesitan con mayor frecuencia, funcionan formando parte de coenzimas. Las principales vitaminas requeridas por los microorganismos son: tiamina (vitamina B1) biotina, piridoxina (vitamina B6) y covalamina (vitamina B12)   Factores de crecimiento

LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 2. Medios de cultivo: composición y preparación 2. 1. Medios de cultivo químicamente definidos 2. 2. Medios complejos (no definidos) 2.3. Tipos de medios de cultivo

Medio definido para Escherichia coli El medio de cultivo químicamente definido se prepara añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un volumen conocido de agua destilada. Se conoce su composición exacta. Medio definido para Escherichia coli K2HPO4 7 g KH2PO4 2 g (NH4)2SO4 1 g MgSO4 0,1 g CaCl2 0,02 g Glucosa 4-10 g Elementos traza 2-10 g (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) Agua destilada 1000 ml pH7

Medio definido para Leuconostoc mesenteroides - K2HPO4 0,6 g - KH2PO4 0,6 g - NH4Cl 3 g - MgSO4 0,1 g - CaCl2 0,02 g - Glucosa 25 g - Acetáto sódico 20 g - Aminoácidos (ala, arg, asn asp,cis, glu, gln, gly, his, iso, leu, lis, met, phe, pro, ser, thr, trp, tyr, val). 100-200 g de cada uno - Purinas y pirimidinas (adenina, guanina, uracilo, xantina). 10 mg de cada una Vitaminas (biotina, folato, ácido nicotínico, piridoxal, piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina, pantotenato, ácido p-aminobenzoico) 0,01-1 mg de cada una Elementos traza 2-10 g (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) Agua destilada 1000 ml pH7

y Leuconostoc mesenteroides Medio complejo para Escherichia coli y Leuconostoc mesenteroides Glucosa 15 g Extracto de levadura 5 g Peptona 5 g KH2PO4 2 g Agua destilada 1000 ml pH7 Para elaborar el medio complejo se utilizan hidrolizados de proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido de agua. No se conoce la composición exacta del medio complejo.

Tipos de medios de cultivo Medios sólidos y líquidos Los medios sólidos se preparan como los medios líquidos y se les añade agar (1.5%) como agente gelificante. El agar es un polímero sulfatado compuesto por D-galactosa, 3,6-anhidro-L-galactosa y ácido glucurónico. El agar se funde a 80-90ºC y se puede enfriar hasta una temperatura de 40 a 42 ºC sin endurecerse. La mayoría de los microorganismos no pueden degradarlo. El agar se funde durante el proceso de esterilización, el medio fundido se vierte sobre placas Petri y se deja solidificar antes de su uso. Los medios sólidos inmovilizan a las células, permitiéndolas crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Medios generales Los medios generales mantienen el crecimiento de muchos microorganismos. Ej., el caldo y agar nutritivo Medios enriquecidos Medios generales a los que se añaden nutrientes especiales para mantener el crecimiento de microorganismos heterótrofos exigentes. Ej., el agar sangre Medios selectivos Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares. Ej.,agar Levine (eosina-azul de metileno) y Agar MacConkey se emplean para detectar enterobacterias. Contienen colorantes y sales biliares que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivas. Otros medios selectivos contienen nutrientes que pueden utilizar algunas bacterias de forma específica. Ej., el agar celulosa se usa para aislar bacterias que digieren la celulosa. Medios diferenciales Medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa de los microorganismos según sus características biológicas. El agar MacConkey es tanto selectivo como diferencial. Como contiene lactosa y colorante rojo neutro, las colonias fermentadoras de lactosa (Escherichia coli) aparecen de color rosa o rojo y se distinguen fácilmente de las colonias no fermentadoras.

LECCIÓN 5. CULTIVO Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 3. Aislamiento de cultivos puros de microorganismos 3.1 Transferencia aséptica 3.2 Siembra en placa por extensión; en estrías; y en profundidad 3.3 Morfología y crecimiento de las colonias

Transferencia aséptica Consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos y de los medios de cultivo estériles. Es uno de los primeros métodos que tiene que dominar un microbiólogo. a.Se calienta el asa de siembra hasta incandescencia y se deja enfriar b. El tubo se destapa c. Se pasa el extremo del tubo por la llama d. Se extrae la muestra con el asa esterilizada e. Se vuelve a flamear la boca del tubo y la muestra se deposita en un medio estéril f. Se vuelve a tapar el tubo y se calienta el asa de nuevo al final

Obtención de cultivos puros Crecimiento de colonias confluentes al comienzo de la siembra por estría 2. Siembra en estrías Se realiza una siembra por estría en una placa de agar con medio estéril. Después de una estría inicail Se hacen estrías en ángulo Colonias aisladas al final de la siembra por estría Se esteriliza el asa y luego se toma una muestra del tubo 1. Dilución y siembra por extensión en superficie 3. Dilución y siembra en profundidad

Morfología y crecimiento de las colonias Las colonias son masas visibles de células que se forman por división de una o varias células. El desarrollo de colonias sobre superficies de agar permite al microbiólogo identificar las bacterias porque las especies forman a menudo colonias con una forma y aspecto característico. El tamaño, forma, textura y color de una colonia es propio de cada organismo. La morfología de la colonia de una bacteria puede variar según el medio en que crezca la bacteria.

Colonias de bacterias Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa Cultivada en Agar MaConkey Pseudomonas aeruginosa Cultivada en Agar Tripticasa-soja Shigella flexneri Cultivada en Agar MacConkey Colonias de Bacillus subtilis que han crecido en medios con pocos nutrientes