Instituto de Virología AMEVEA Aspectos de la interacción virus-hospedador a tener en cuenta en el diagnóstico y control de la Laringotraqueítis Infecciosa Ariel Vagnozzi Instituto de Virología INTA Castelar. Bogotá, 17 de abril de 2012 Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias

Reseña 1925 Primer reporte de la enfermedad (May & Tittsler. Tracheolaryngitis in Poultry. J. Am. Vet. Assoc. 67: 229-231). 1931 El comité de enfermedades de las aves de la AVMA adoptó la denominación de Laringotraqueítis Infecciosa (Infectious Laryngotracheitis) 1934 Primera inmunización contra LT(Brandly & Bushnell (A report of some investigations of Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 13: 212-217). 1937 El agente etiológico de LT fue reconocido como un agente filtrable (virus) (Beudette. Infectious Laryngotracheitis. Poult. Sci. 16: 103-105).

Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV) Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV). También Gallid Herpesvirus 1 (GaHV-1). α-Herpesvirus Rango de hospedador Pollos (Gallus gallus domesticus) y faisanes (Phasianidae) son los únicos hospedadores naturales reconocidos. ILTV replica en la parte alta del tracto respiratorio. Inmunología El título de anticuerpos neutralizantes no correlaciona bien con protección (Fahey et al, 1983) Respuesta mediada por células parece jugar el rol principal en la inmunidad (Fahey et al, 1984) Gransow et al, 2001

Laringotraqueítis Período de incubación Signos Clínicos Lesiones Infección experimental (intratraqueal): 2 a 4 días Signos Clínicos Tos, estornudos, expectoración de mucus fibrina y sangre, y marcada disnea. Conjuntivitis. Lesiones Conjuntiva, laringe, y tráquea (ocasionalmente pulmones).

Entre Ríos, 2010

Lesiones: Diversos grados de conjuntivitis

Lesiones: Diversos grados de traqueítis Imágenes provistas por Dr. G. Zavala

Epidemiología ILTV tiene distribución mundial. Mortalidad entre 0 y 70% (dependiendo de la virulencia de la cepa). Latencia Luego de la fase aguda Reactivación generalmente inaparente Aves muy jóvenes presentan menor susceptibilidad

Latencia Replicación viral Diseminación viral Ganglio del trigémino Luego de la fase aguda de la infección Stress Latencia Ganglio del trigémino Virus de campo y vacunas vivas atenuadas Replicación viral Tráquea Reactivación desde latencia es generalmente inaparente Diseminación viral

Diagnóstico de ILTV Signos clínicos y lesiones Detección de anticuerpos Pueden ser muy característicos Virus neutralización Aislamiento viral EP CEK Aves (mayores de 14 días) AGID Embrión de pollo ELISA Cultivo primario de células Histopatología Inmunofluorescencia Inmunohistoquímica PCR PCR en tiempo real

Muestras para el diagnóstico etiológico Ave con signos incipientes Mucosa de la conjuntiva. Hisopado Parpado incluyendo conjuntiva Tracto respiratorio alto. Tráquea Raspado de tráquea (con bisturí) Hisopado de tráquea

Hisopado de tráquea

Hospedador susceptible Control de ILTV: Evitar que el virus contacte al hospedador susceptible Bioseguridad Bioseguridad Vacunación Fuente de infección Hospedador susceptible Transmisión Vacunación

Vacunas Vacunas vivas atenuadas: CEO: Embrión de pollo (Chicken Embryo Origin). TCO: Cultivo celular (Tissue Culture Origin). Vacunas vectorizadas en virus (recombinantes): FPV-LT: Expresa gB (UL-27) y MAP (UL-34) de ILTV. HVT-LT: Expresa gI (US-7) y gD (US-6) de ILTV.

Evaluación de la protección inducida (bajo condiciones experimentales) por vacunas recombinantes y atenuadas.

+ Diseño general del estudio Se evaluó: Signos clínicos Tratamientos Vacunación Desafío (cepa 63140) vía edad 35 DO 1 NVx-NCh - 2 CEO Gota en ojo 14 DO + 3 TCO 4 HVT-LTio in ovo 18 ED 5 HVT-LTsc subcutánea 1 DO 6 FPV-LTio 7 FPV-LTsc 8 NVx-Ch Se evaluó: Signos clínicos Carga viral en tráquea

Materiales and métodos

Materiales and métodos

Desafío a los 35 días de edad Resultados

Desafío a los 35 días de edad Resultados

Para el desafío a 35 días de edad Signos clínicos: NVx-NCh CEO TCO HVT-LT io HVT-LT sc < FPV-LT io FPV-LT sc NVh-Ch (P < 0.05) Carga viral: < < < FPV-LT sc FPV-LT io NVx-Ch NVx-NCh CEO HVT-LT io HVT-LT sc TCO

Conclusiones del experimento Vacunas atenuadas mayor protección ante el desafío Basado en los signos clínicos, la protección inducida por: HVT-LT fue similar a la conferida por las vacunas atenuadas. FPV-LT resultó menor que la conferida por las vacunas atenuadas. . La dificultad de las vacunas vectorizadas para generar el clearence de virus en la tráquea sugiere que cierta diseminación viral podría estar ocurriendo en los planteles vacunados con este tipo de vacuna.

Estudio preliminar de los mecanismos de la vacuna CEO Pollos SPF vacunados (Vx) Pollos SPF Naïve (NVx) Vx-Ch Vx-NCh NVx-Ch NVx-NCh Muestras fueron tomadas a las 6 y 12 horas post-desafío (hpch)

Carga viral en tráquea a las 6 y 12 Hs Carga viral en tráquea a las 6 y 12 Hs. post desafío con una cepa virulenta de ILTV de aves vacunadas (CEO) y no vacunadas.

¿Por qué no es conveniente utilizar CEO? Virulencia residual Latencia Aves vacunadas pueden convertirse en fuente de virus para aves susceptibles Posibilidad de reversión Caracterización de muestras de campo (Oldomi et al, 2007; 2008). Mayoría (cerca del 70 %) de las muestras de campo presentaron patrón de RFLP idénticas o muy cercano a CEO.

Vacunas atenuadas Wild-type Vacuna Atenuación Virulencia Virulencia Pasajes en serie Cultivo celular / embrión Atenuación Atenuación Atenuación

Pasajes en serie Wild-type Vacuna Atenuación Reversión Virulencia Cultivo celular / embrión Wild-type Atenuación Vacuna Virulencia Virulencia Atenuación Atenuación Hospedador Reversión

Importancia de la dosis inicial en la infección con ILTV Diseño del ensayo Título (TCID50/ave) Número de aves (broilers) NCh 12 2 x 101 2 x 102 2 x 103 2 x 104

Carga viral de las aves infectadas con baja dosis (10 TCID50/ave)

Caracterización de aislamientos de ILTV de Argentina (2006-2012).

Caracterización genotípica de aislamientos Argentinos de ILTV (2006-2012)

Se resolvió prohibir el uso de vacuna CEO en Argentina Datos de muestras procesadas en el laboratorio de Sanidad Aviar de INTA EEA Concepción del Uruguay (Entre Ríos) Se resolvió prohibir el uso de vacuna CEO en Argentina

Estos interrogantes abrirán nuevas líneas de investigación Cierta replicación viral (en ausencia de manifestaciones clínicas severas), podría estar ocurriendo en el campo en aves vacunadas (TCO o vectorizadas). No se observan signos de enfermedad ¿Es posible que luego de sucesivos ciclos productivos con animales inmunizados con HVT-LT o con TCO, la carga viral ambiental se reduzca hasta desaparecer? ¿Qué tan factible sería dejar de vacunar planteles alojados en zonas donde hubo brotes de ILTV? ¿Cuántos ciclos productivos son necesarios para tomar la decisión de suspender la vacunación con cierto grado de seguridad? Una compañía dejó una granja sin vacunar ¿Qué variables deberían evaluarse antes de decidir la suspensión de la vacunación? ILTV! ¿Evaluación de anticuerpos séricos por ELISA? ¿Uso de aves centinela? Estos interrogantes abrirán nuevas líneas de investigación

Agradecimientos University of Georgia (PDRC) Dra. Maricarmen García Dr. Guillermo Zavala Dr.Andrés Rodríguez Ávila Dr. Taylor Barbosa Ms. Sylva Riblet Dra. Alice Mundt INTA Instituto de Virología Dr. Ariel Pereda Dra. María Isabel Craig INTA EEA Concepción del Uruguay Dr. Federico Vera Lic. Florencia Rojas

Muchas gracias!