Tema-14. Las enzimas en el interior celular 1.- Velocidad total para el modelo S P 2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado estacionario 3.-Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas: Método de King y Altman 4. Análisis de la ecuación

Modelo que cumple la condiciones de partida de M&M: 1. Velocidad total * Hasta ahora hemos considerado cinéticas sencillas, in vitro, descritas por el modelo: E S <===> P Modelo que cumple la condiciones de partida de M&M: Las reacciones se han estudiado en condiciones de velocidades iniciales, que son velocidades unidireccionales extrapoladas a tiempo cero. La velocidad total, vt, no es la suma algebraica de dos velocidades iniciales.

* Por otro lado, en el interior de la célula, es decir, in vivo, el producto de reacción, P, siempre está presente, por lo que no es posible extrapolar el comportamiento de la enzima en la célula a las condiciones de velocidades iniciales de las condiciones in vitro. * Para intentar acercarnos a las condiciones de in vivo, intentaremos estudiar la velocidad de reacción total, vt, S <===> P Para el que, en este caso, si se cumple: vt = v1 - v2 Donde: v1 es la velocidad actual de la reacción S --> P v2 es la velocidad actual de la reacción P --> S

k1 k3 k5 E + S ES EP E + P k2 k4 k6 [Eo] = [E] + [ES] + [EP] * Teniendo en cuenta los distintos complejos que se pueden formar, podemos escribir el modelo, de una manera más realista, de la siguiente manera: k1 k3 k5 E + S ES EP E + P k2 k4 k6 Para este modelo se cumplirá: [Eo] = [E] + [ES] + [EP] En este modelo las k son constantes de velocidad, los subindices nones nos indican la dirección izquierda a derecha y los pares la dirección de derecha a izquierda. La concentración total de enzima es igual a la suma de las especies química en las que pueda estar la enzima.

vt = k1[E ][S] - k2[ES] = k5[EP] - k6[E][P] Calculo vt necesitamos conocer las concentraciones siguientes: [E] y [ES] o [E] y [EP] Plantear las correspondientes ecuaciones diferenciales y resolverlas asumiendo una situación de estado estacionario: [So] >>>[Eo] [ES] despreciable frente a [S]

2.- Resolución de la ecuación de velocidad en el estado estacionario Cálculo del valor de las concentraciones de las diferentes formas de las Enzimas en el estado estacionario. Plantea un sistema de ecuaciones Empezamos por la enzima libre k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6

k1. k3. k5. E + S <===> ES <===> EP <===> E + P. k2 k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6 [ES] k1 k3 k5 E + S <===> ES <===> EP <===> E + P k2 k4 k6 [EP]

Tenemos un sistema de 4 ecuaciones y tres incógnitas (E, ES, y EP), que de acuerdo con el Teorema de Rouché tendrá solución si una de las ecuaciones es combinación lineal de otras dos. ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] [E] + k2 [ES] + k5 [EP] iii) 0 = k1(S) [E] - (k2+k3) (ES) + k4 (EP) iv) 0 = k6(P) [E] + k3 [ES] - (k4+ k5) [EP] i) [Eo] = [E] + [ES] + [EP] -1[ii) + iii)] = iv)

0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + k5(EP) + k4(EP) ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP) iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP) 0 = - k1(S)(E) – k6(P)(E) + k1(S)(E) + k2(ES) – k2(ES) –k3(ES) + k5(EP) + k4(EP) 0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + k5(EP) + k4(EP) 0 = – k6(P)(E) – k3(ES) + (k4+ k5)(EP) Si multiplicamos por -1 0 = k6(P)(E) + k3(ES) - (k4+ k5)(EP) Que es exactamente igual que la ec: iv) 0 = k6(P) (E) + k3 (ES) - (k4+ k5) (EP)

vt = k1[E][S] - k2[ES] Luego el sistema tiene solución Por lo tanto, para calcular la velocidad total vt, vt = k1[E][S] - k2[ES] Sólo necesitamos calcular [E] y [ES] * Aplicando la regla de Cramer al sistema formado por las tres primeras ecuaciones: ii) 0 = -[k1(S) + k6(P)] (E) + k2 (ES) + k5 (EP) iii) 0 = k1(S) (E) - (k2+k3) (ES) + k4 (EP) i) (Eo) = 1(E) + 1(ES) + 1(EP)

Y teniendo en cuenta que la matriz de coeficientes, , viene dada por: 1 1 1 -[k1(S) + k6(P)] k2 k5 k1(S) - (k2+k3) k4  = El cálculo de [E] y de [ES] lo podemos realizar de la siguiente manera:

Resolución de un determinante de orden 3 0 k2 k5 0 -(k2+k3) k4 1 Eo 1 -(k1(S) + k6(P) 0 k5 K1(S) 0 k4 [E]= [ES]= 1 1 1 -[k1(S) + k6(P)] k2 k5 k1(S) - (k2+k3) k4 1 1 1 -[k1(S) + k6(P)] k2 k5 k1(S) - (k2+k3) k4 Resolución de un determinante de orden 3

Las concentraciones en estado estacionario serán

(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P] Llevando a la ecuación de velocidad total vt = k1[E][S] - k2[ES] Reorganizando algebraicamente (k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo ------------------------------------------------------------------------------ (k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P]

(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P] * Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes microscópicas de velocidad (k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo ------------------------------------------------------------------------------ (k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P] Es una ecuación de manejo complicado No es fácil obtener las Constantes cinéticas Solución transformación según el tratamiento de Michelis-Menten Obtención de constantes cinéticas michaelentianas

(k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P] Transformación función de las constantes cinética características de la enzima KmS, KmP, VmaxS y VmaxP (k1k3k5)[S] - (k2k4k6)[P] vt = Eo ------------------------------------------------------------------------------ (k2k4+k2k5+k3k5) + (k1k3+k1k4+k1k5)[S] + (k2k6+k3k6+k4k6)[P] Numerador 1 num1= (k1k3k5) Numerador 2 num2= (k2k4k6) Constante Cte = (k2k4+k2k5+k3k5) Coeficiente de Substrato coefs= (k1k3+k1k4+k1k5) Coeficiente de Producto coefp= (k2k6+k3k6+k4k6)

Substituimos num1[S] – num2 [P] vt = Eo ----------------------------------------------------- cte + Coefs [S] + Coefp [P] Multiplicando y dividiendo numerador y denominador por Teniendo en cuenta las defiiniciones de las constantes cinéticas de Michaelis para el Substrato y Producto KmS y KmP y las velocidades máximas VmS y VmP

Los valores se deducen en velocidades iniciales por lo tanto [P] = 0 K6 y k4 son iguales a 0 Coefp es cero k3 es el paso limitante de la reacción global (despreciable como sumando frente a k5) Se deduce lo mismo para el lado contrario P S k4 =0 y k3<<<k5

Esta es la ecuación de velocidad total obtenida en función de las constantes de velocidad de Michaelis-Mentem (Vm y Km) y de la concentración de S y de P. VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P]

3.- Resolución gráfica de ecuaciones cinéticas: Método de King y Altman Método esquemático para la resolución de ecuaciones con mecanismo cinético complejo El método gráfico, de K&A, consiste en la construcción, en primer lugar, de un polígono de tantos vértices como especies químicas puede presentar la enzima. Para el sistema más simple: E + S <==> ES <==> EP <==> E + P En el estado estacionario la concentración total del enzima será igual a la suma de todas las especies químicas de esta ES E EP Se utiliza para todos los sistemas: Con más de un Substrato y Producto

ES E EP ES E EP S k1 k2 P k6 k5 k3 k4 * A continuación se construyen tantos polígonos abiertos como lados tiene el polígono, dejando un lado abierto en cada uno de ellos.

ES E EP S k1 k2 k3 k4 ES E EP S k1 k2 P k6 k5 ES E EP P k6 k5 k3 k4

* Por otro lado, se cumple que la razón entre una determinada especie química [EXi] y la concentración total de enzima [Eo], [Exi]/[Eo], es igual a la suma de los términos que afectan a la especie, partido por la suma de todos los términos que afectan a todas las especies.  de los términos que afectan a la especie EXi [EXi]/[Eo] = -----------------------------------------------------------------------  de los términos que afectan a todas las especies químicas ¿Cómo calculamos el numerador y el denominador? * Los términos que afectan a una especie se calculan en cada polígono abierto recorriendo el camino para llegar a la especie , multiplicando las constantes de velocidad y las concentraciones de S y P, si hubiera lugar.

[E] (k2k4) + (k2k5) + k3k5) ES E EP S k1 k2 k3 k4 ES E EP S k1 k2 P k6

[ES] (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) EP S k1 k2 k3 k4 ES E EP S k1 k2 P k6 k5 ES E EP P k6 k5 k3 k4 [ES] (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P)

[EP] (k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P) ES E EP S k1 k2 k3 k4 ES E EP S k1 k2 P k6 k5 ES E EP P k6 k5 k3 k4 [EP] (k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P)

[E] (k2k4) (k2k5) (k3k5) [ES] (k1k4S) (k1k5S) (k4k6P) FORMAS DE LA ENZIMA TÉRMINOS [E] (k2k4) (k2k5) (k3k5) [ES] (k1k4S) (k1k5S) (k4k6P) [EP] (k1k3S) (k2k6P) (k3k6P)

vt = k1[E][S] - k2[ES] Así pues, (k2k4 + k2k5 +k3k5) [E] = [Eo] --------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P) (k1k4S + k1k5S + k4k6P) [ES] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P) (k1k3S + k2k6P + k3k6P) [EP] = [Eo] ------------------------------------------------------------------------- (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P) - Como vt viene dado por: vt = k1[E][S] - k2[ES] - Sustituyendo los valores de [E] y [ES] tendremos:

(k2k4 + k2k5 +k3k5) (k1k4S + k1k5S + k4k6P) vt = k1[Eo] ------------------------ [S] - k2[Eo] ------------------------------ t t Donde: t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + (k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) +(k1k3S + k2k6P + k3k6P) y operando, obtenemos: (k1k2k4S + k1k2k5S +k1k3k5S - k1k2k4S - k1k2k5S - k2k4k6P) vt = [Eo] [----------------------------------------------------------------] t

t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + k1(k3k4k5) (S) + k6(k2k3k4) (P) -Simplificando (k1k3k5) (S) (k2k4k6) (P) vt = [Eo] [------------------ - -------------------] t t - Si en t ordenamos las contantes y sacamos factor común, podemos escribir: t = (k2k4 + k2k5 +k3k5) + k1(k3k4k5) (S) + k6(k2k3k4) (P) Cte. CoefS CoefP

* Expresión de la ecuación de velocidad total en presencia de P y S Usando estas simplificaciones, e introduciendo otras, y operando adecuadamente. * Expresión de la ecuación de velocidad total en presencia de P y S VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ---------------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P] Misma ecuación que la obtenida en mediante la resolución de sistemas de ecuaciones diferenciales en el estado estacionario

4. Análisis de la ecuación: VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ----------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P] 1. En condiciones de velocidad inicial [P] = 0, la ecuación se convierte en la ecuación de M-M VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ----------------------------------------- KmS KmP + KmP[S] + KmS[P] Tarea. Si consideramos velocidades iniciales, qué forma tomará la anterior ec. general para la reacción en sentido P --> S?

2. En condiciones de velocidad iniciales y unidireccionales si [P] ≠ 0 La ecuación tiene el siguiente valor Kcat dirección S es 0 VmP = 0 Ecuación similar a la de la Inhibición competitiva. El producto si está presente en velocidades iniciales se comporta como un inhibidor competitivo

VmS KmP[S]eq - VmP KmS[P]eq = 0 3. Relación de Haldane En condiciones de equilibrio químico, vt = 0, se deduce la siguiente relación: VmS KmP[S] – VmP KmS[P] vt = ---------------------------------------------= 0 KmS KmP + KmP[S] + KmS[P] VmS KmP[S]eq - VmP KmS[P]eq = 0 - Donde [S]eq y [P]eq son las concentraciones en el equilibrio. [P]eq VmS KmP Keq = --------- = ----------------- [S]eq VmP KmS Relación que recibe el nombre de Relación de Haldane.

- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes cinéticas . Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que: VmSKmP G’º = -RT ln ------------- VmPKmS Las constantes cinéticas son fáciles de calcular experimentalmente.

VmaxS KmP(S) - VmaxP KmS(P) Resumen • El análisis cinético de M-M está referido a velocidades iniciales En el interior celular in vivo el producto de la reacción está siempre presente, habrá que tener en cuenta la velocidad total no las velocidades iniciales Velocidad total es la suma de las velocidades unidireccionales Las ecuaciones referidas a las velocidades totales solamente se resuelven en el estado estacionario: Variación de las concentraciones de las diferentes especies químicas en las que se encuentre la enzima respecto al tiempo es cero Resolución de las ecuaciones de velocidad total se realizada con diferente aproximaciones: Estado estacionario,se obtiene una expresión de velocidad total en función de las constantes cinéticas Vms, Vmp, Kms Kmp y de las concentraciones de P y S. Resolución gráfica propuesta por King y Altman método sencillo permite la resolución de planteamientos enzimáticos complejos VmaxS KmP(S) - VmaxP KmS(P) vt = ------------------------------------------------- KmS KmP + KmP(S) + KmS(P) Relación de Haldane, cuando la velocidad total es cero es decir en condiciones de equilibrio relaciona la constante de equilibrio con las constantes cinéticas de la enzima (estudiadas de acuerdo con las condiciones de M-M).