Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet: Shigella flexneri y Enterobacter sakazakii 5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL) 23 al 25 de octubre 2007 Norma Binsztein Angela Salve

protocolo estandarizado de PFGE Shigella flexneri a PulseNet Desarrollo de protocolo estandarizado de PFGE para incorporación de Shigella flexneri a PulseNet

Necesidades de un protocolo diferente a) Shigella flexneri especie mas frecuente en América Latina y en Asia b) PFGE de Shigella sonnei estandarizado en PulseNet c) Resultados de PFGE de aislamientos de Shigella flexneri con el protocolo de Shigella sonnei d) Pedido de PN-AL a PN-Internacional de estandarizar protocolo de PFGE para Shigella flexneri aceptación

Objetivos específicos Estandarizar un protocolo de PFGE y análisis para Shigella flexneri Objetivos específicos Utilizar las mismas condiciones de corrida para dos enzimas Simple, económico, reproducible y epidemiológicamente discriminatorio

Condiciones de corrida Antecedentes Serotipos de Shigella Condiciones de corrida Enzimas Conclusiones CDC 1,2,3 Shigella sonnei vs Campylobacter vs Yersinia pestis vs Yersinia modificado XbaI NotI Yersinia Modificado XbaI / NotI InstitutoMalbrán 1 a 6 Campylobacter SfeI

Grupo de trabajo en PFGE y BioNumerics de Shigella flexneri Reunión Comité Directivo de PN Internacional Providence, USA - 16 de Abril 2007 Presentación de resultados preliminares (CDC e Instituto Malbrán) Integrantes CDC NAMRU (US Naval Medical Rescarch Unit INEI – Malbrán

Protocolo de trabajo Condiciones de corrida Enzimas XbaI y NotI 1ª etapa: Mayo a Octubre 2007 Campylobacter vs Yersinia modificado Condiciones de corrida Enzimas XbaI y NotI Aislamientos seleccionados - 7 de cada serotipo de Shigella flexneri - de brotes 2ª etapa: Validación

Conclusiones preliminares 1º etapa Condición de corrida protocolo Yersinia modificado Enzimas XbaI y NotI 1ª enzima NotI 2ª enzima XbaI Buena discriminación de aislamientos asociados a brotes ? Ventajas y Desventajas Definición: noviembre 2007

Ejemplos: XbaI-PFGE Shigella flexneri 1, digeridas con XbaI con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado 2 1 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg

Ejemplos: NotI-PFGE Shigella flexneri 1, digeridas con NotI, con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Protocolo Campylobacter 6,8 a 35,4 seg Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg

protocolo estandarizado de PFGE Enterobacter sakazakii a PulseNet Desarrollo de protocolo estandarizado de PFGE para incorporación de Enterobacter sakazakii a PulseNet

Enterobacter sakazakii PulseNet América Latina está a cargo del desarrollo Antecedente 2006: PFGE de 22 aislamientos con la condición de corrida de Shigella sonnei enzima XbaI Resultados a mejorar Condición de corrida: Yersinia modificado enzima XbaI

Enterobacter sakazakii 2007 Resultados preliminares XbaI-PFGE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protocolo Shigella sonnei 2,2 a 54,2 seg Protocolo Yersinia modificado 1,8 a 25 seg

Enterobacter sakazakii Plan de trabajo 2007-2008 Continuar el estudio de todos los aislamientos existentes en la colección de cultivos del INEI (n=22) - condiciones Yersinia modificado - enzimas XbaI y otra a elegir Realizar el análisis y comparación de los resultados con los dos protocolos (Shigella sonnei y Yersinia modificado) Discutir los resultados en el Comité Ejecutivo de PN-Internacional Seleccionar método Validar

protocolo estandarizado de PFGE para Salmonella sp., Shigella sonnei Modificaciones del protocolo estandarizado de PFGE para Salmonella sp., Shigella sonnei y E. coli O157 5ta Reunión PulseNet América Latina (PN-AL) 23 al 25 de octubre 2007 Angela Salve

Principales Modificaciones DO de las suspensiones bacterianas DO de 1.0 a 610 nm NO AGREGAR SDS al 1% en la agarosa utilizada en la preparación de los “plugs”. Se puede usar una menor cantidad de enzima por “plug” (20 - 30 U)

Utilización de Tiourea en cepas No Tipificables

Cepas No Tipificables Hay aislamientos que muestran ADN degradado en el gel y se consideran no tipificables por PFGE Ejemplos: algunas cepas de E. coli O157 y no O157; ciertas serovariedades de Salmonella, como Derby, Livingston, Ohio, Panama, Saintpaul y Cerro (donde todos los aislamientos pueden ser no tipificables) o algunas cepas de ciertas serovariedades tales como Newport, Miami y otras, que generalmente se pueden tipificar por PFGE El agregado de 50 μM de tiourea en el buffer de corrida previene la degradación de ADN COMO ACTÚA??? Durante la electroforesis se forma un derivado perácido de Tris en el ánodo, éste compuesto degrada ADN en cepas que tienen sitios lábiles de modsificación . La tiourea protege al ADN al capturar radicales reactivos del Tris No funciona con cepas No Tipificables por otra causa

Ejemplo de la Utilización de Tiourea Salmonella Cerro Sin Tiourea Con Tiourea

Muchas Gracias a TODOS