PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE TALLOS DE YUCA (Manihot esculenta crantz) PRETRATADOS Yamil Liscano Martíneza, Ángela Adriana Ruiz-Coloradoa, Sandra Dazaa, Alejandra María Peláez Ruiza, Hader Castaño Peláezb, Alfredo Martinezc, Cessna Mossc a Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín b Politécnico Jaime Isaza Cadavid, Medellín, Colombia c Universidad autónoma de México, Cuernavaca, México

(https://liberiamissionblog.wordpress.com/, 2014) INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Problemas Fig 1. Materiales lignocelulósicos para producción de etanol Beneficios Disminuyen reservas petróleo 7% anual (Zandvliet, 2011) Alta disponibilidad, 200 mil millones Ton anuales (Ragauskas, 2006) Contaminación ambiental Co2 6-8 gigatoneladas anuales (López et al., 2011) Reducción 80% gases invernadero (Londo,2010) Seguridad alimentaria (Sánchez y Cardona, 2008) Adaptación a condiciones difíciles (Aguilera, 2012) (https://liberiamissionblog.wordpress.com/, 2014)

Hidrólisis enzimática Pretratamiento Fermentación INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Fig 2. Etapas para la producción de etanol de biomasa lignocelulosica HFI (Hidrólisis y fermentación independiente) E.coli MS04 Lignocelulósicos (Lynd et al, 2002) Hidrotratamiento Ácido diluido Solventes orgánicos AFEX Hidrólisis alcalina Hidrólisis enzimática Pretratamiento Fermentación *Aumenta tasa de hidrólisis por conversión de azúcares *Requerimiento bajo de enzima *Eleva rendimiento producto *Disminuye inhibición enzimática *Duración corta proceso SFS (Sacarificación y fermentación simultánea) S.cerevisiae (Ethanol Red) Hidrólisis enzimática + Fermentación Etanol (Sun y Cheng, 2002)

INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVO METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA El objetivo de este trabajo fue obtener etanol de tallos de yuca, mediante la evaluación de los pretratamientos ácido diluido e hidrotérmico, y SFS con S.cerevisiae e HFI con E.coli MS04.

INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Tabla 1. Factores de cada proceso con diferentes niveles y la variable respuesta. Diseño Central compuesto con superficies de respuesta. Proceso Factores Niveles Tipo de variable Variable respuesta Hidrotérmico (Pabón y Ospina, 2009; Garrote, 2001; Ballesteros ,2002) Temperatura (°C) 159,77 - 210,23 Aleatoria Rendimiento g de azucares (xilosa + glucosa)/ g biomasa inicial) Tiempo (minutos) 1,59 - 18,41 Concentración de sólidos (% p/v) 8,3 - 12,5 Tamaño de partícula (mm diámetro) 2 – 3 mm Fija Ácido diluido (Pabón y Ospina, 2009; Garrote, 2001; Ballesteros ,2002; Sassner, 2008) 135 - 164 Concentración de ácido (%p/p) 0,146 -0,854 10 2 -3 mm 5 SFS (Castaño, 2011) Actividad enzimática (FPU/mL) 4-11 Etanol (g/L) Inóculo (g/L) 1,59 - 4,41 38°C Fijo Agitación (rpm) 130 Tiempo (horas) 72

Fig 3. Proceso de producción de etanol de tallos de Yuca INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Fig 3. Proceso de producción de etanol de tallos de Yuca Pretratamiento Hidrotérmico: 18,3 – 12,5% sólidos, Volumen 200mL, 1,59 -18,41 min Pretratamiento ácido diluido: 10% sólidos Volumen 200mL 0,85% ácido 164 °C 5 min Tallos de Yuca: Variedad Copiblanca, Urabá Molidos (2-3mm diámetro) 9,64% Humedad inicial Caracterización (NREL) Hidrólisis enzimática: 10% sólidos Celulasa: Multiefect B 56,92 FPU/mL Volumen 100 mL 50°C pH:4,8 SFS: S.Cerevisiae (Ethanol Red) Hexosas 10% sólidos Volumen 50mL 38°C pH: 5,0 Celulasa: Celluclast 33 FPU/mL 130 rpm 72 horas Fermentación: E.Coli MS04 Hexosas y Pentosas Volumen 2L 37°C pH:7,0 300 rpm 48 horas Etanol (HPLC fase reversa)

Componente Este Trabajo * ( %) Celulosa 39,82 ± 0,62 Hemicelulosa INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Tabla 2. Caracterización tallos de Yuca Componente Este Trabajo * ( %) Celulosa 39,82 ± 0,62 Hemicelulosa 7,34 ± 0,11 Lignina 30,36 ± 0,41 Cenizas 3,72 ± 0,02 Extractivos total 22,25 ± 0,99 Total 103,48 *Datos de la tabla metodología NREL basado en peso seco

Hidrólisis enzimática de pretratamiento hidrotérmico INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Hidrólisis enzimática de pretratamiento hidrotérmico Figura 4. Contorno. Relación % Sólido- Tiempo – Rendimiento de azúcares (Xilosa+Glucosa) / gramos biomasa inicial. Tabla 3. ANAVA del rendimiento azúcares (G+X/Biomasa inicial) Termino Coeficiente p Constante 0,0269 0,0000 Temperatura (°C) 0,0018 0,4620 Tiempo (min) -0,0047 0,0750 Sólidos (%) 0,0089 0,0040 Temperatura (°C)*Tiempo (min) -0,0107 0,0690 Temperatura (°C)*Sólidos (%) 0,0009 0,8710 Sólidos (%)*Tiempo (min) -0,0039 0,4710 R2 0,74 Shapiro Wilk 0,837

Hidrólisis enzimática de Pretratamiento ácido diluido INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Hidrólisis enzimática de Pretratamiento ácido diluido Tabla 4. ANAVA del rendimiento azúcares (G+X/Biomasa inicial) Fig 5. Contorno. Relación % Ácido – Temperatura – Rendimiento de azúcares (Xilosa+Glucosa) / gramos biomasa inicial. Termino Coeficiente p Constante 0,0664 0,0000 Concentración ácido (%) 0,0027 0,6960 Temperatura 0,0238 0,0080 Temperatura (°C)* Concentración ácido (%) 0,0229 0,1270 R2 0,80 Shapiro Wilk 0,296

INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Fig 6. Rendimientos azúcares fermentables después de hidrólisis enzimática

Valores promedio g azucares/g biomasa en natura INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Validación óptimo ácido diluido Fig 7. Valores óptimos para los factores del pretratamiento ácido diluido despues de hidrólisis Enzimática Tabla 5. Condiciones para confirmar la condición óptima Factores Variable respuesta Condición Acido (%) Sólidos (%) Tiempo (minutos) Temperatura (°C) Valores promedio g azucares/g biomasa en natura Desviación estándar 1 0,75 10 5 160 0,5265 0,0287 2 0,85 164 0,6688 0,1177 3 170 0,5049 0,1429 4 1,5 175 0,3783 0,0288 Tabla 6. ANAVA Suma de cuadrados GL Cuadrado medio F p Entre grupos 0,313 3 0,104 11,593 0,002 Dentro de grupos 0,072 8 0,009 Total 0,385 11  

Hidrólisis y fermentación independiente (HFI) INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Hidrólisis y fermentación independiente (HFI) Fig 8. Producción de etanol y consumo de azúcares (E.coli MS04) Tabla 7. Parámetros evaluados de las fermentaciones Cepa Tiempo (h) Y p/s (g/g) Producción de Etanol (g/L) Productividad (g/Lh) Rendimiento ( %) Azúcares iniciales (g/L) E.coli 24 0,48 8,87 0,37 94,44 19,12

Sacarificación y fermentación simultánea (SFS) INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Sacarificación y fermentación simultánea (SFS) Fig 9. Producción de Etanol y Consumo de Glucosa (S. cerevisiae)

Sacarificación y fermentación simultánea (SFS) INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Sacarificación y fermentación simultánea (SFS) Fig 10. Contorno. Relación Actividad enzimática – Inóculo-Rendimiento de azúcares (Xilosa+Glucosa) / gramos biomasa inicial. Tabla 8. ANAVA concentración de etanol (g/L) Término Coeficiente p Constante 1,1909 0,000 Actividad enzim. 0,1918 0,003 INOCULO 0,3026 FPU*INOCULO -0,1348 0,160 R2 0,95 Shapiro Wilk 0,630 7,5 FPU/mL de actividad enzimática y 3,67 g/L del inóculo

El pretratamiento que mejor dio resultados fue el ácido diluido. INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE TALLOS DE YUCA (Manihot esculenta crantz) PRETRATADOS Los tallos de yuca Variedad Copiblanca presentan potencial para la producción de azúcares fermentables. El pretratamiento que mejor dio resultados fue el ácido diluido. La levadura Ethanol Red, en SFS produjo un máximo de 2,38 g/L de etanol La cepa de E.coli MS04, consume tanto pentosas como hexosas con rendimientos del 94% y con concentraciones de etanol de 8,87 g/L.

Bibliografía BALLESTEROS I, J.M. OLIVA, M.J. NEGRO, P. MANZANARES, M. BALLESTEROS. (2002) Enzymatic hydrolysis of steam exploded herbaceous agricultural waste (Brassica carinata) at different particule sizes. Departamento de Energıas Renovables (DER), CIEMAT, Madrid, Spain. CASTAÑO, HI., REALES, J. & ZAPATA, J. (2011) Sacarificación y fermentación simultánea de tallos de yuca. Dyna, 180. p. 97-104. FERNANDEZ, M.T., HUERTA, G., TRUJILLO, B., BUSTOS, P., GONZALEZ, V., BOLIVAR, F., GOSSET &G., MARTINEZ, A. (2012) Laboratory metabolic evolution improves acetate tolerance and growth on acetate of ethanologenic Escherichia coli under non-aerated conditions in glucose-mineral medium. Appl Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s00253-012-4177-y. GARROTE, G., DOMIINGUEZ, H., & PARAJÓ, J. C. (2001). Generation of xylose solutions from Eucalyptus globulus wood by autohydrolysis - posthydrolysis processes: posthydrolysis kinetics. Bioresource Technology, 79, 155–164. HAN, M., KIM, Y., CHUNG, B. & CHUI, G.W. (2011) Bioethanol production from optimized pretreatment of cassava stem. Korean J ChemEng 28. p. 19-125. LONDO, ME., DEURWAARDER, G., FISCHER, S., PRIELER, H., VAN VELTHUIZEN, M., DE WIT, A. FAAIJ. (2010) A roadmap for biofuels in Europe. Biomass and Bioenergy 34. p. 244–250. LYND L.R., WEIMER P.J., VAN ZYL W.H., PRETORIOUS I.S. (2002) Microbial cellulose utilization. Fundamentals and biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66(3): 506-577.

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Fig 11. Modificaciones genéticas a la cepa E.coli (Fernández, 2012)

Fig 12. Distribución tamaño de partícula después de moler

Este artículo antes de pretratamiento* INTRODUCCIÓN ANTECEDENTES OBJETIVOS METODOLOGÍA RESULTADOS CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA Tabla 2. Caracterización tallos de Yuca Componente Este artículo antes de pretratamiento* Han et al., 2010* Castaño et al., 2011** Martín et al., 2007 *** ( %) (%) Celulosa 39,82 ± 0,62 35,2 38,8 Hemicelulosa 7,34 ± 0,11 24,3 7,2 12, 3 Lignina 30,36 ± 0,41 33,8 11,8 31 Cenizas 3,72 ± 0,02 2,2 - 8 Extractivos total 22,25 ± 0,99 7,6 Total 103,48 95,5  57,8 94,1 *Datos de la tabla metodología NREL basado en peso seco **Datos de la tabla metodología Van Soest basado en peso seco. *** Datos Lignina de Klason

Fig 13. Control SFS