Ingeniería Genética de la producción de etanol en Escherichia coli

Presentación del tema: "Ingeniería Genética de la producción de etanol en Escherichia coli"— Transcripción de la presentación:

1 Ingeniería Genética de la producción de etanol en Escherichia coli

2 Se insertaron los genes de las enzimas esenciales de la vía fermentativa de Zymomonas mobilis para producir etanol en E. coli.

3 Zymomonas mobilis Bacilo gram negativo Microaerofílica a anaerobia
Metabolismo fermentativo obligado con producción de etanol Vía de Entner-Douduoroff

4 Durante la glucólisis, las células convierten azúcares simples, como glucosa, en piruvato, con producción neta de ATP y NADH

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6 Los m.o. son muy diversos en la gama de productos de fermentación.
Entre los que se incluyen ácidos orgánicos, (lactato, acetato, succinato, etc) y otros como etanol, butanol, acetona. La diversidad de los productos de fermentación tiene gran utilidad taxonómica. Aplicaciones biotecnológicas

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8 OBJETIVOS Clonar y expresar las enzimas piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenes de Zymomonas mobilis en E.coli TC4, bajo el control de un único promotor, generando un operon artificial, para la producción de EtOH

9 MATERIALES Y MÉTODOS

10 E. coli TC4 (LB + glu)‏ Plásmido pLOI276 (piruvato descarboxilasa)‏ Plásmido pLOI284 (alcohol deshidrogenasa)‏ Plásmido pLOI295 (ambas enzimas)‏ A550nm___________1DO – 0.25mg/ml Métodos genéticos: transformación, selección de transformantes, etc, articulo anterior Actividad enzimática. uM/mg prot/min Células- disrupción celular- inactivación de otras enz. de E.coli que reducen NAD+, por calor- medición de proteínas totales. Control Z mobilis Análisis de los productos de fermentación. HPLC. HPX-87H

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12 RESULTADOS

13 FIG. 2. Comparison of plasmid-free strain TC4 and strain TC4 carrying plasmids encoding alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase on solid medium. All plates were incubated under aerobic conditions. Panels A, B, and C show petri plates in which strain TC4 (prototrophic for relevant markers) and plasmid-containing derivatives were streaked in the same orientation for comparison. The lower streak in each of these three panels is plasmid-free strain TC4, the left streak is strain TC4(pLOI276), the right streak is strain TC4(pLOI284), and the upper streak is strain TC4(pLOI295). The plate in panel A was incubated for 2 h at 37°C. The acetaldehyde produced by alcohol dehydrogenase reacted with pararosaniline to produce the diffusible red pigment observed in this alcohol dehydrogenase indicator plate (5). The plates in panels B, C, and D were incubated overnight at 37°C. The plate in panel B contains Luria broth without added glucose. The plates in panels C and D contain Luria broth containing 2% glucose. Panel D is a photograph of transformants which grew in Luria broth with glucose as progeny of a ligation during the construction of pLOI295. The large white colonies (two of which are marked by arrows) were subsequently found to contain plasmid pLOI295.

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15 Fermentación de la glucosa por las cepas recombinantes
Los productos de fermentación fueron analizados por HPLC y los picos observados identificados utilizando estándares de las sustancias puras. Cultivos en caldo Luria al 10 % de glucosa - anaerobiosis

16 E. coli TC4 → succinato (1,5 mM), lactato (18 mM) y acetato (7 mM) principalmente
Expresión operon pet en condiciones de anaerobiosis → etanol, 750 mM

17 TC4 (pLOI284) - gen adh – perfil similar al de TC4
TC4 (pLOI276) - gen pdc – se observa un pico correspondiente al etanol, 18 mM (piruvato decarboxilasa Z. mobilis + alcohol deshidrogenasa E. coli)‏

18 E. coli con operon pet → ↑ alcohol deshidrogenasa y ↑ piruvato decarboxilasa dominan la oxidación de NADH en cepa pLOI295. Km piruvato decarboxilasa de Z. mobilis: 0,4 mM Km lactato deshidrogenasa: mM El piruvato se desvía hacia la producción de etanol y la fermentación de E.coli se hace equivalente a la de S. cerevisiae y Z. mobilis.

19 Crecimiento Desviación del flujo de piruvato hacia la producción de etanol afecta rendimiento celular y pH del medio.

20 TC4 y TC4 pLOI284 (alcohol deshidrogenasa II):
*0,25 mg proteina celular/ mL *pH 4,4 TC4 pLOI276 (piruvato decarboxilasa): *mg proteina celular/ mL se duplica *pH 4,5 TC4 operon pet: *250 mg proteina celular/ mL *pH 4,7

21 Producción de ácidos orgánicos acidifica el medio limitando el crecimiento en todos los casos.
A partir de una densidad de 2,5 mg de proteína celular/mL, Mg2+ se vuelve limitante

22 Discusión Reemplazo de enzimas nativas de E. coli para la fermentación por aquellas de Z. mobilis sin reducir la tasa de crecimiento → productos de fermentación producidos son relativamente inocuos para E. coli. Útil en la producción de productos metabólicos específicos a partir de sustratos no convencionales o por transferencia de vías metabólicas a partir de otros m.o.