CROMATOGRAFÍA Mikhail Tswett, 1906 Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico

CROMATOGRAFÍA Separación de los componentes de una mezcla (muestra), disueltos en una fase móvil a medida que se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase estacionaria

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS ESTADO FÍSICO DE LAS FASES: Fase Móvil - Gaseosa (Cromatografía de gases) - Líquida (Cromatografía Líquida) Fase Estacionaria - Líquida (inmovilizada, soporte) - Sólida

TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS CRITERIOS DE SEPARACIÓN: 1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”) Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil y estacionaria en función de sus características. La composición de la fase móvil es constante. 2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida) Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la composición de la fase móvil para eluirlos.

CROMATOGRAFÍA DE REPARTO SOLUBILIDAD Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar 2. TAMAÑO (exclusión molecular) Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas separadas por una especie de tamiz o malla

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN INTERCAMBIO IÓNICO Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico 2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Fase estacionaria hidrofóbica 3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA Fase estacionaria con ligandos inmovilizados 4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA hidroxiapatita, colorantes inmovilizados

TIPOS DE CROMATOGRAFíA Tipo de interacción/reparto Tipo de cromatografía Reparto Solubilidad Fase Normal Fase Reversa Tamaño Exclusión Molecular Interacción Electrostática Intercambio aniónico Intercambio catiónico Hidrofóbica Afinidad biológica Ligandos inmovilizados Inmunoafinidad Afinidad inespecífica Hidroxiapatita Colorantes

FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC) 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

TERMINOLOGÍA FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico) componente estático de la cromatografía FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

TERMINOLOGÍA CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución. Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el eluído de una columna VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a través de la columna hasta que sale cada soluto VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA Registrador Solventes (fase móvil) Bomba(s) COLUMNA Detector (UV) Mezclador Inyector Colector de fracciones

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

Waters, Millipore

Perceptive BioSystems, BioCAD

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE HPLC

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA (manual)

SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIÓN

ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS MEDIANTE DIÁLISIS

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR Volumen de líquido en los intersticios (Vo) en las partículas (Vi) Volumen ocupado por la matriz (Vg) Volumen de elución (ml) 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 Absorbancia (280 nm) VT = Vo+ Vi + Vg Volumen total de líquido (Vt) Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR Nombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño Sephadex G-50 dextran 1500 - 30000 Sephadex G-100 dextran 4000 - 150000 Sephacryl S-200 HR dextran 5000 - 250000 Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose 6000 - 70000 Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose 12000 - 130000 Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose 20000 - 400000 Bio-Gel P-60 polyacrylamide 3000 - 60000 Bio Gel P-150 polyacrylamide 15000 - 150000 Bio-Gel P-300 polyacrylamide 60000 - 400000

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR: Estimación de masas moleculares Marcadores de masa molecular Recta de calibrado 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 A280 nm 25 kD 67 kD 14 kD 43 kD Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml) 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 A280 nm Proteína problema Log Mr

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR VENTAJAS: Flexibilidad en cuanto a solvente Condiciones poco agresivas Proporciona información estructural INCONVENIENTES: Poco resolutiva, debido a difusión La muestra se diluye Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños Etapas finales de protocolos de purificación

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR: Columnas de “desalado” 0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.2 0.0 2.0 0.3 kD 120 kD Volumen de elución (ml) Cambio de solvente Purificación de fragmentos de DNA marcados (fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD

INTERCAMBIO IÓNICO

INTERCAMBIADORES IÓNICOS FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO SOPORTES: RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno) - Densidad muy alta de grupos intercambiadores - Muy hidrofóbicas: desnaturalización de biomoléculas - Eliminación de impurezas iónicas de solventes químicos y de tampones Purificación de agua POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

INTERCAMBIADORES IÓNICOS

INTERCAMBIADORES IÓNICOS Tipo Grupo cargado Abreviatura De aniones Fuerte Dietil-2-hidroxipropilamino etilo QAE Débil Dietilamino etilo DEAE De cationes Sulfo propilo SP Carboxi metilo CM CH2CH3 + -CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3 CH2CH3 CH2CH3 + -CH2CH2-N-H CH2CH3 - -CH2CH2-CH2-SO3 - -CH2-COO3

INTERCAMBIADORES IÓNICOS + aniónico débil (DEAE) aniónico fuerte (QAE) carga pH catiónico fuerte (SP) catiónico débil (CM) -

INTERCAMBIO IÓNICO K= [Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)] Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+) [Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)] K= [Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales Adsorción. Baja fuerza iónica. Intercambio aniónico, pH >pI Intercambio catiónico, pH < pI Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. Elución. Modificación de la fase móvil: aumento de fuerza iónica + pH pI -

INTERCAMBIO IÓNICO GRADIENTE DISCONTINUO 0.5 2.0 [NaCl] (M) - - - - Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Número de fracción

INTERCAMBIO IÓNICO GRADIENTE LINEAL 0.5 2.0 [NaCl] (M) - - - - Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Número de fracción

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA 2.0 1.0 [Sal] (M) - - -- Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Número de fracción

CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas (PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN- (NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC) 2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL - Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras de celulosa del papel - Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla) Cromatografía de reparto, fase normal

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Aplicación de la muestra: volumen mínimo Desarrollo de la cromatografía: Extremo sumergido en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de la muestra. Recipiente cerrado herméticamente. Ascendente/descendente Detección de las sustancias separadas: Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes) Tinción Autorradiografía (compuestos radiactivos)

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Optimización de cromatografía en papel Fase estacionaria: fina capa (0.15-0.5 mm) de sólido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o cristal. Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel

VENTAJAS DE LA TLC Característica Efecto Ventaja Fase estacionaria finamente dividida Elevada acción capilar Rapidez de desarrollo Elevada superficie de contacto f. móvil f. estacionaria Eficiencia cromatográfica Sensibilidad Ausencia de estructura fibrosa Reducida dispersión de los solutos durante aplicación y desarrollo Válida cualquier fase estacionaria que pueda ser pulverizada Versatilidad

MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC Aplicación Color Inespecífico Vapores de Iodo C. orgánicos Pardo-amarillento H2SO4 + calor Negro (carbonización) Específico 2,4-dinitrofenilhidracina C. carbonílicos Naranja AgNO3/OH- Marrón Ácido iodoplatínico Bases Púrpura-negro Verde de bromocresol Ácidos Verde-amarillento Ninhidrina Aminas 1rias (aminoácidos) Azul-violáceo Rodamina 6G Lípidos fluorescencia

FACTOR DE RETARDO (Rf) Rf = Frente del solvente soluto Distancia migrada por el soluto Rf = Distancia migrada por el frente origen

TLC BIDIMENSIONAL 2ª dimensión 1ª dimensión punto de aplicación

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD + glucose

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Equilibrado. Ajuste a condiciones iniciales. Adsorción. Alta fuerza iónica. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. Elución. Competición con ligando libre Desnaturalización (pH, temperatura, agentes caotrópicos) 2.0 Adición de ligando libre Absorbancia (280 nm) 0.0 20 40 60 80 100 Número de fracción

LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA Activación del soporte Anclaje covalente del ligando Bloqueo de grupos reactivos remanentes O-C-NH-ligando OH NH agarosa = C=N agarosa OH O + NH2-ligando agarosa + CNBr OH O

PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

INMUNOPRECIPITACIÓN

INMUNOPRECIPITACIÓN