Canales de iones 8 de abril CURSOS_2010 FISIOLOGIA GENERAL

En los trabajos prácticos de los días lunes se usará programas Excel que están junto con la guía correspondiente en El trabajo práctico lo pueden desarrollar en la sala de computación del Edificio G que estará disponible los días lunes entre las 14:30 y las 18 horas en forma exclusiva para este curso, y con apoyo de los ayudantes. Pero lo pueden desarrollar en cualquier momento durante la semana y en cualquier computador que tenga acceso a la red. Los estudiantes trabajarán en grupos de 4 personas La ejecución del trabajo práctico es obligatoria y se controlará por la entrega de un informe por cada grupo de trabajo. El informe se debe redactar en un documento legible bajo MS Word (.doc o.docx) comprimido (.zip o.rar) que se debe enviar como adjunto a una carta electrónica dirigida a antes de las 23:59:59 del lunes siguiente de la fecha del trabajo Se recomienda que el nombre al archivo contenga claves que lo identifique con los integrantes del grupo.

Proyecto escolar Telégrafo

Estudio de canales de iones incorporados en membrana artificiales hechas de fosfolípidos. Los canales de iones tiene dos estados, abierto y cerrado: conductor y no- conductor. Tal como el interruptor del telégrafo

Fosfolípidos Fosfatidil colina, PC Fosfatidil etanolamina, PE Fosfatidil serina, PS Fosfatidil inositol, PI Estudio de canales de iones incorporados en membrana artificiales hechas de fosfolípidos. Un poco de estructura.

Fosfolípidos Fosfatidil colina, PC DPPC = Di Palmitoleoyl Phosophatidyl Choline

Fosfatidil serina, PS Fosfolípidos

Fosfatidil etanolamina, PE Fosfolípidos

Fosfatidil inositol, PI Fosfolípidos

A diagonal molecular slab from the DPPC lipid bilayer simulation1; color scheme: PO4 - green, N(CH3)3 - violet, water - blue, terminal CH3 - yellow, O - red, glycol C - brown, chain C - grey. Image taken from a research page of Dr. Richard W. Pastor. (NIH)

250  m

KCl 100mM KCl 1M Experimentos en membranas bicapas de lípidos La membrana se forma pincelando en la perforación una solución de fosfolípidos en decano. El proceso de formación de la bicapa se observa con una lupa y midiendo la capacidad eléctrica. Separación Perforación Ag/AgCl KCl 100mM ¿Cómo se puede medir la capacidad eléctrica?

VVV Vóltmetro de 10 k  Vóltmetro de 100 k  Vóltmetro de 1 M  Vóltmetro ideal debe tener resistencia infinita Ampérmetro ideal debe tener resistencia cero A A A Ampérmetro de 10 k  Ampérmetro de 1 k  Ampérmetro de 100  0.50 V0.91 V 0.99 V mA0.091 mA0.099 mA

+ - o Esto se cumple para todo circuito con realimentación negativa Vóltmetro ideal Realimentación negativa, negative feedback Ganancia 1

+ - o I R f Ampérmetro Para cualquier intensidad de corriente. Resistencia = 0: ampérmetro ideal

Membrana VmVm Generador de ondas Osciloscopio RfVo = -IRf Rf = 10 9 Ohm = 1 G  VmVm -IRf 0

Tiempo 2 ms / división Potencial: 100 mV / división 5 V / división Membrana VmVm -IRf Generador de ondas Osciloscopio Rf

250  m

Tiempo 2 ms / división Potencial: 100 mV / división 5 V / división Membrana VmVm -IRf Generador de ondas Osciloscopio Rf

Tiempo 2 ms / división Potencial: 100 mV / división 5 V / división Membrana VmVm -IRf Generador de ondas Osciloscopio Rf

Tiempo 2 ms / división Potencial: 100 mV / división 5 V / división Membrana VmVm -IRf Generador de ondas Osciloscopio Rf

12 de abril 2010 Canales de iones

En los trabajos prácticos de los días lunes se usará programas Excel que están junto con la guía correspondiente en El trabajo práctico lo pueden desarrollar en la sala de computación del Edificio G que estará disponible los días lunes entre las 14:30 y las 18 horas en forma exclusiva para este curso, y con apoyo de los ayudantes. Pero lo pueden desarrollar en cualquier momento durante la semana y en cualquier computador que tenga acceso a la red. Los estudiantes trabajarán en grupos de 4 personas La ejecución del trabajo práctico es obligatoria y se controlará por la entrega de un informe por cada grupo de trabajo. El informe se debe redactar en un documento legible bajo MS Word (.doc o.docx) comprimido (.zip o.rar) que se debe enviar como adjunto a una carta electrónica dirigida a antes de las 23:59:59 del lunes siguiente de la fecha del trabajo práctico. Se recomienda que el nombre al archivo contenga claves que lo identifique con los integrantes del grupo.

100m M KCl KCl 1M Experimentos en membranas bicapas de lípidos Separación Perforación Ag/AgCl VmVm I m V m es la variable que se controla I m es la variable que se mide 0 En la membrana pondremos muy pocos canales. La intensidad de la corriente será muy baja por lo que esperamos que las reacciones en los electrodos estén muy cerca del equilibrio.

Corriente, amper/volt Voltaje Canal B, salida del ampérmetro = 4 volt de sensibilidad A/V T1T2 Canal B, voltaje.

Incorporación de canales a la bicapa V = 100mV Intensidad de corriente a V=100mV, KCl 100mM / KCl 100mM

Incorporación de canales a la bicapa V = 100mV Conductancia de 1 canal, g: Intensidad de corriente a V=100mV, KCl 100mM / KCl 100mM

90mV 70mV 50mV 30mV 10mV Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

Corriente del canal abierto a diferentes voltajes. Con esta observación comprobamos esta suposición: Con comprobación sólo vale para estos canales y hay que comprobarla para cada canal que estudiemos.

90mV 70mV 50mV 30mV 10mV Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

Corriente promedio de 1 canal en a diferentes voltajes.

La conductancia de la membrana es función del potencial eléctrico, V m Conductancia cuerda

Conductancia promedio del canal a diferentes voltajes. ¿Cómo explicar que la conductancia dependa del potencial?

90mV 70mV 50mV 30mV 10mV Corriente de 1 canal en KCl 100 mM/KCl 100mM

Cálculo del promedio de la corriente. Si sólo se dan dos clases de resultados: i 1 = 0 con una probabilidad q y i 2 = i con una probabilidad p = 1-q: La corriente promedio para una membrana con N canales con corriente unitaria i es: Es la suma de cada valor de corriente i k multiplicado por la probabilidad de cada valor p k

Cálculo de la varianza de la corriente Si sólo se dan dos clases de resultados: i 1 = 0 con una probabilidad q y i 2 = i con una probabilidad p = 1-q, y el promedio es ip. Demostrar que para una membrana con 2 canales la varianza es : Demostrar que para una membrana con N canales la varianza es : Es la suma de los cuadrados de la diferencia entre cada valor y el promedio multiplicado por la probabilidad de cada valor p k

Intensidad de la corriente y su varianza para una membrana con N canales Conductancia y su varianza para una membrana con N canales En el máximo de la parábola se cumple que Parábola

abierto canal el encontrar de adProbabilid abierto canal del iaConductanc promedio iaConductanc    P0P0 g g

Historia de 1 canal en el tiempo. Fotografía instantánea de muchos canales. Si las dos determinaciones de Po dan el mismo resultado entonces el sistema es ergódico

K = Constante de equilibrio Abierto Cerrado Como P o depende del potencial eléctrico, constante de equilibrio, K, debe depender del potencial eléctrico. La llamamos entonces K V

Extracelular Intracelular Bicapa Estructura de los canales de K dependientes de voltaje. S1 S3a S6 Doyle et al 1998 Science 280: Jiang et al 2003 Nature 423: (Temas de seminario)

Estructura de los canales de K dependientes de voltaje Jiang et al 2002 Nature 417: Jiang et al 2002 Nature 417: Jiang et al 2003 Nature 423: Jiang et al 2003 Nature 423: Long et al 2007 Nature 450: Más detalles estructurales en (tema de seminario):

15 de Abril de 2010 Canales activados por voltaje

Vm = +60 mVVm = -60 mV Posible movimiento del segmento S4 impulsado por las diferencias de potencial eléctrico. Despolarizar Hiperpolarizar Compuerta abiertaCompuerta cerrada Filtro de selectividad ( Na +, K +, Ca 2+ ) Papers para seminarios sobre este punto: Aggarwal y MacKinnon. (1996) Neuron 16, 1169–1177. Larsson, et al (1996) Neuron, 16, 387–397. Ahern y Horn 2004 TINS 27: V 0 = 0

Cerrado Abierto V 0 = 0 V i = V m CerradoAbierto Potencial químico del componente i = cambio de la energía libre del sistema al agregar 1 mol del componente i a temperatura, presión, y el número de moles de los otros componentes constantes.

Cerrado Abierto V 0 = 0 V i = V m CerradoAbierto

Cerrado Abierto V 0 = 0 V i = V m En equilibrio,  = 0

¿A que V m se encuentra n cerrado = n abierto, Kv = 1?

Significado de la valencia z. Al aplicar un potencial positivo el canal se abre. La apertura de un mol de canales implica una disminución de la energía libre. Una carga de 2.5 veces el número de Faraday (zF) se mueve desde un lugar en que el potencial es V m (positivo) a otro en que el potencial es Vm = +60 mV Vo = 0 mV

Significado de la valencia z. Al aplicar un potencial negativo el canal se cierra. El cierre de un mol de canales implica una disminución de la energía libre. Una carga de 2.5 veces el Número de Faraday (zF) se mueve desde un lugar en que el potencial es 0 a otro en que el potencial es V m (negativo) Vm = -60 mV Vo = 0 mV ¿Cómo se entiende que no sea un número entero?

Significado del producto zV 0. El producto zV 0 es una medida de la diferencia de potencial químico estándar entre el estado cerrado y el abierto. Estos canales están cerrados a V m = 0 Para abrirlos en un 50% se necesita entregar 12 kJ/mol.

Problema: ¿Cómo encontrar los parámetros z y Vo de la función de Boltzmann, dado un conjunto de determinaciones experimentales? Solución usando métodos de los mínimos cuadrados y la planilla de cálculos MS Excel® Po V m, mV

Cinética Ya estudiamos la probabilidad de encontrar un canal abierto en función de la diferencia de potencial a través de la membrana. Ahora estudiaremos la probabilidad de encontrar un canal abierto en función del tiempo.

90mV 70mV 50mV 30mV 10mV Corriente de 1 canal en KCl 100 mM/KCl 100mM

Cerrado Abierto V 0 = 0 V i = V m Abierto Cerrado   Este equilibrio depende de V m, por lo tanto , , o ambas, deben ser funciones de V m El modelo de dos estados

Abierto Cerrado    Probabilidad por unidad de tiempo que se abra un canal cerrado. (s -1 )  Probabilidad por unidad de tiempo que se cierre un canal abierto (s -1 ) P o (t) Probabilidad de encontrar el canal abierto a un tiempo t.

La constante c se determina para t = 0 Determinamos que para t  ∞ x(∞) = 0

Si Po(∞) = 0 Si Po(0) = 0

A t =  la probabilidad de encontrar el canal abierto es =  /(  +  ). A t = 0 la probabilidad de encontrar el canal abierto es = 1. La escala vertical es pA/nn =1 n =2 n =3n =5n =10 n =100

Caso: P o(0) = 1

Caso: P o(0) = 0

Calcular Po(t) para Po(0)=1 y Po(∞)=0 Calcular Po(t) para Po(0)=0 y Po(∞)=1

Cálculo de  y  a partir de Po(  ) y 

¿Qué nos enseña el análisis de la duración de los eventos abiertos y cerrados?

90mV 70mV 50mV 30mV 10mV Corriente de 1 canal a KCl 100 mM/KCl 100mM

El canal se cierra para nunca más abrirse, entonces Po(  ) = 0,  = 0 y  =  -1 El canal está abierto a tiempo cero, entonces Po(0) = 1. La probabilidad que un canal abierto a tiempo cero siga abierto a tiempo t es p (>t).

Probabilidad que un canal abierto dure al menos un tiempo t sin cerrarse.

Función de densidad de probabilidad. Área = 1 La probabilidad que un canal abierto a t = 0 dure un tiempo entre t y t+dt es  e -  t dt

Cálculo de la duración promedio de los eventos. Se puede calcular as constantes  y  midiendo la duración promedio de los eventos cerrados y abiertos.

¿Cómo cambian con el voltaje las constates  y  ?.

V extracelular = 0 V intracelular = V m AbiertoCerrado Tránsito del estado abierto al cerrado pasa por un estado activado “a medio camino” entre el inicial y el final: La carga se mueve desde un potencial 0 hasta un lugar en que el potencial es una fracción x de Vm: La energía de activación del proceso es: xV m

AbiertoCerrado Tránsito del estado cerrado al abierto pasa por un estado activado “a medio camino” entre el inicial y el final: La carga se mueve desde un potencial V m hasta un lugar en que el potencial es una fracción x de V m : La energía de activación del proceso es: xV m V extracelular = 0 V intracelular = V m

ExtracelularIntracelular Cerrado Abierto 0 mV G Jmol -1

ExtracelularIntracelular 0 mV V m mV 0 mV xV m mV 0 mV Cerrado Abierto G Jmol -1

ExtracelularIntracelular 0 mV Cerrado Abierto G Jmol -1

ExtracelularIntracelular 0 mV V m mV 0 mV xV m mV 0 mV Cerrado Abierto G Jmol -1

ExtracelularIntracelular 0 mV V m mV 0 mV xV m mV 0 mV Cerrado Abierto G Jmol -1

La constante cinética de la transición de abierto a cerrado es . La constante cinética de la transición de cerrado a abierto es .

Hay un potencial al cual se igualan la energías de activación y por lo tanto las constantes cinéticas La dos constantes cinéticas para V = V 0 son iguales y la llamamos  0 =  0

Suponiendo de los factores de proporcionalidad son todos iguales podemos escribir.

En la función Po no aparece x. Para el caso x = 0.5

Fin.