Axón de jibia 2 de abril de 2007 Clases/VoltageClampK.ppt 04/04/2007 03:11:36 p.m.

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1 Axón de jibia 2 de abril de 2007 http://einstein.ciencias.uchile.cl/Fisiologia2007/ Clases/VoltageClampK.ppt 04/04/2007 03:11:36 p.m.

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3 Axón de jibia Electrodo que inyecta corriente V x (t) + _ o Electrodos para medir el potencial Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón. Circuito con realimentación negativa: V O = V +

4 Estímulo en de 25  A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio. 0.00 ms

5 0.04 ms Estímulo en de 25  A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

6 0.12 ms Estímulo en de 25  A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

7 0.52 ms Estímulo en de 25  A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0. Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.

8 1.00 ms

9 1.24 ms

10 1.88 ms

11 2.28 ms

12 2.92 ms

13 3.72 ms

14 4.60 ms

15 5.48 ms

16 6.44 ms

17 8.04 ms

18 8.84 ms

19 9.80 ms

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21 12.52 ms

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23 Axón de jibia Electrodo que inyecta corriente Electrodos para medir el potencial Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón. V x (t) En cada punto del axón pasa algo diferente, esto complica el análisis, tratemos de simplificar eliminando la variable espacio

24 Eliminando la variable espacio Electrodo que inyecta corriente V x (t) La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. R o = 0 El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. R i = 0. ¿Qué valor toma la constante de espacio?

25 Eliminando la variable espacio Electrodo que inyecta corriente El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana. V (t) Electrodo que mide potencial A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).

26 Potencial de acción de membrana

27 Space clamp Electrodo que inyecta corriente V i (t) PERO mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial extracelular Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular. Electrodo que mide potencial intracelular

28 Space clamp Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular. Vi (t) Electrodo que mide potencial intracelular Ve (t) Electrodo que inyecta corriente Electrodo que mide el potencial extracelular

29 Medida de Vm Vi (t) Ve (t)

30 Medida de Vm Vi (t) Ve (t) R R 0 V -Vi

31 Medida de Vm Vi (t) Ve (t) R R -Vi R R 0 V Vi -Ve R Vm ?

32 Space clamp Electrodo que inyecta corriente Vm (t) Electrodo que mide potencial intracelular Electrodo que mide el potencial extracelular

33 Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) V comando El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad. Voltage clamp VmVm

34 Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp) El potencial de la membrana es igual al comando. El ampérmetro A mide la corriente que pasa por 1 cm lineal de axolema. A Voltage clamp V comando VmVm

35 ExtracelularIntracelular Voltage Clamp

36 Extracelular Intracelular Vm RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC VmVm Tiempo ImIm VrVr Voltage clamp de un circuito pasivo

37 VmVm Tiempo ImIm VrVr Voltage clamp de un circuito pasivo Extracelular Intracelular RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC

38 VmVm Tiempo ImIm VrVr Eliminando la corriente capacitiva X X Extracelular Intracelular RmRm VrVr CmCm ImIm IiIi ICIC

39 VNa GNaGK VK Extracelular IntracelularVm I Na I K ImIm Corrientes iónicas a Vm = 0 en un circuito con dos vías paralelas VmVm Tiempo ImIm Vm=V r Vm=0

40 I, mA/cm 2 t, ms Voltage clamp de un axón de jibia -60,8mV 0mV

41 FUGU es un plato japonés que se prepara con la carne del pez globo pufferfish (especies Takifugu, Lagocephalus, or Sphoeroides) o del pez puercoespín (género Diodon). Debido a que el pez globo es un letalmente venenoso si se prepara en forma incorrecta, el fugu es el plato más celebrado y famoso de la cocina japonesa.TakifuguLagocephalusSphoeroidesDiodon Reino:Animalia Filo:Chordata Subfilo:Vertebrata Clase:Actinopterygii Orden:Tetraodontiformes Familia:Tetraodontidae Género:Takifugu Abe, 1949 FUGU

42 Tetrodotoxin (anhydrotetrodotoxin 4-epitetrodotoxin, tetrodonic acid, TTX) es una neurotoxina sin un antídoto conocido. Bloquea los potenciales de acción en los nervios uniéndose a los canales de sodio rápidos de las membranbas celulares de los nervios. El Dr. Yoshizumi Tahara la aisló en 1909 y la llamó tetrodotoxina, nombre derivado de Tetraodontiformes, el orden al que pertenece el pez globo.Yoshizumi TaharaTetraodontiformes

43 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na Control TTX

44 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.

45 ExtracelularIntracelular Voltage Clamp G Na y G K son funciones de V m y t

46 Canales de potasio de axón de jibia 5 de abril de 2007 http://einstein.ciencias.uchile.cl/Fisiologia2007/ Clases/VoltageClampK.ppt

47 I, mA/cm 2 t, ms Voltage clamp de un axón de jibia -60,8mV 0mV

48 I, mA/cm 2 t, ms -60,8mV 0mV Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na Control TTX

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64 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? Vm, mV I K, mA cm -2

65 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? ? Vm, mV I K, mA cm -2 -39.1 mV G K = 43.4 mS cm -2 V K = -39.1 mV

66 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? ? Vm, mV I K, mA cm -2 -39.1 mV G K = 43.4 mS cm -2 V K = -39.1 mV

67 Conductancia G K ? Potencial de inversión, V K ? Vm, mV I K, mA cm -2

68 Estrategia para buscar el potencial de inversión V K. Sospecha: V K = -94 mV Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué? Porque los canales están cerrados a -94 mV. Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V. V m, mV IK, mA/cm 2

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80 Los canales de K obedecen a la ley de Ohm: La P O de la ecuación es la probabilidad de encontrar el canal abierto a 0 mV.

81 V K =-73.4 mV Sorpresa: El valor encontrado es mayor que -94mV, el esperado según Nernst. Explicación: Los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na. Tarea: Calcular G K /G Na para estos canales

82 V m, mV IK, mA/cm 2 V K =-73.4 mV

83 V m, mV IK, mA/cm 2

84 No. La forma de la curva no corresponde a una función de Boltzmann.

85 Extracelular Intracelular Bicapa Estructura de los canales dependientes de voltaje. 124 5 6 1 2 3 4 5 6 Shrivastava, I. H., Durell, S. R. & Guy, H. R. (2004) Biophys. J. 87, 2255–2270. Más detalles estructurales en (tema de seminario): P loop

86 + + + + Vm = +60 mVVm = -60 mV Posible movimiento del segmento S4 impulsado por las diferencias de potencial eléctrico. Despolarizar Hiperpolarizar Compuerta abiertaCompuerta cerrada Filtro de selectividad ( Na, K, Ca ) Aggarwal,. & MacKinnon. (1996) Neuron 16, 1169–1177. Larsson, et al 1996. (1996) Vol. Neuron, 16, 387–397, Papers para seminarios sobre este punto:

87 Los canales de K son tetrámeros. Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina. Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo Los sensores de potencial operan en forma independiente. El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos. Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo La probabilidad de encontrar un canal abierto es...n4n4

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90 Vm, mV G K, mS/cm 2 Resultado de Solver: G K max = 34 mS/cm 2 V 0,n = -51.6 mV z n = 1.2

91 nn V m, mV

92 Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos usando el análisis de las corrientes de cola.

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104 V m, mV G K , mS/cm 2 I Kcola @-60mV, mA/cm 2 G K  mS/cm 2 I Kcola @60mV, mA/cm 2 Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos usando el análisis de las corrientes de cola. La corriente de cola es la medida a -60 mV, siendo la probabilidad de encontrar abiertos los canales igual a la correspondiente a V m

105 Cinética

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107 Tarea: Demuestre que la corriente de cola decae exponencialmente para el caso en que n  = 0. Relacione la constante de tiempo de la corriente de cola con  n cuando n  = 0. 40 mV -140 mV

108 40 mV -140 mV

109 ¿Cómo determinar  n ? 40 mV -140 mV

110  n a diferentes voltajes

111 n  a diferentes voltajes Demostrar que:

112  n y  n a diferentes voltajes Demostar que  n =0,1 para límite V m  -50 mV

113 Ng k = 34 mS/cm 2 V K = -74,2 mV Descripción completa de los canales de K del axón de jibia nn nn

114 Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV. Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.