Biología Molecular en el IHI

Estudios Moleculares Hemoglobinopatías: Sicklemia -talasemia Hemopatías malignas

ESTUDIOS MOLECULARES EN ANEMIA DREPANOCÍTICA (SICKLEMIA) Diagnóstico prenatal Detección de -talasemia Determinación de los haplotipos asociados al gen S

Diagnóstico Prenatal de la Sicklemia PRIMERA APLICACIÓN CLÍNICA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL MUNDO Y EN CUBA. 1978- polimorfismo Hpa I. 1982- estudio directo de la mutación s. 1983- primer DP de la SS en el IHI. 1983- Primer lugar en el concurso “Premio Anual de la Salud”. Se realizaron los primeros 100 estudios.

- talasemia en SS Se determinó la frecuencia de -talasemia en pacientes SS (234 pacientes estudiados). frec (- ) SS: 0.1880 frec (- ) no-blancos AA: 0.1136 p 0.001 Encontramos que la -talasemia aumenta con la edad, es decir, que aumenta la sobrevida. (G.Martinez et al: Age dependence of the gene frequency of  - thalassemia in sickle cell anemia in Cuba. Blood 88: 1898,1996).

Haplotipos asociados al gen s Se determinó la frecuencia de los diferentes haplotipos asociados al gen s (91 pacientes estudiados). Benin: 51% Bantú: 41% Senegal: 8% Se encontró que la frecuencia del haplotipo Bantú disminuye y el Senegal aumenta con la edad del paciente SS. (A. Muñiz et al: Sickle cell anemia and - gene cluster haplotypes in Cuba. Am J Hematol 1995, 49: 163).

Bases Moleculares de la -talasemia Se establecieron las bases moleculares de la -talasemia en la población cubana. Se identificaron 17 mutaciones diferentes. Las mutaciones más frecuentes fueron: Codón 39 (30.5%) IVS1- 110 (8.5%) -29 (13.4%) IVS2- 1 (8.5%) La gran variabilidad de las bases moleculares hace muy difícil el diagnóstico prenatal de la talasemia mayor y de la S/ -talasemia. Los resultados moleculares conjuntos en SS y -talasemia constituyeron el tema de una Tesis de Doctorado.

Estudios Moleculares en Hemopatías Malignas Reordenamiento de los genes de las Igs y RT en síndromes linfoproliferativos. Genes híbridos originados por translocaciones y otras alteraciones en leucemias. Quimerismo molecular en TMO

con la técnica de Southern Comienzan en 1985 con la técnica de Southern

Resultados en esta primera etapa (1980-90) Los estudios del reordenamiento de los genes de las Igs y del RT que demostraron: Heterogeneidad molecular en la LLC. Reordenamiento no productivo en LLC (mutación tipo talasemia). Estos resultados, unidos al estudio inmunológico y la evaluación clínica recibieron el Primer Lugar en el “Premio anual de la Salud” (1989). Se contribuyó al diagnóstico y estadificación de los linfomas.

Resultados en esta primera etapa (cont.) Se realizaron aportes en la LMC apoyando los resultados de otros autores sobre la heterogeneidad molecular de esta entidad. Estos estudios en LMC dieron lugar a una Tesis de Doctorado.

En 1996 se introduce la técnica de RT-PCR

Alteraciones moleculares estudiadas en el IHI Alteración Gen híbrido t(15;17) PML-RAR t(12;21) TEL-AML1 t(8;21) AML1-ETO t(9;22) BCR-ABL t(4;11) MLL-AF4 inv 16 CBF-MYH11 DIT FLT3

Leucemia Mieloide Aguda Alteración No. de casos % PML-RAR 104 (97) 93.0 AML1-ETO 78 (15) 20.0 CBF-MYH11 80 (4) 5.0 MLL-AF4 52 (1) 2.0 DIT FLT3 108 (17) 17.0 (DIT FLT3 (+) en LPA: 53%)

LMA con Subtipo Dudoso Diagnóstico Morfológico Diagnóstico Molecular 2 pacientes M3 ó M4 1 M4 1 M3 t(15;17) 4 pacientes M2 ó M3 1 M3 t(15;17) 3 M2 t(8;21) 1 paciente M3 ó M7 1 M3 t(15;17)

Leucemia Promielocítica Aguda El estudio molecular comenzó en 1995. 104 pacientes estudiados 97 (93 %) pacientes RT-PCR+ 7 ( 7 %) pacientes RT-PCR – (En un paciente – se comprobó PLZF-RARA) Frecuencia de los puntos de ruptura (bcr): bcr 1: 66 % bcr2: 5 % bcr3: 29 %

Posible quimera M3:M5 en LPA: diferente respuesta clonal al tto Posible quimera M3:M5 en LPA: diferente respuesta clonal al tto. con ATRA y quimioterapia

Leucemia Linfoide Aguda Alteración No. casos % TEL-AML1 164 (33) 21.0 BCR-ABL 154 (3 M; 7 m) 6.5 MLL-AF4 154 (5) 3.2

Leucemia Mieloide Crónica t(9;22) bcr-abl Puntos de ruptura No. Casos % p210 b3-a2 61 (35) 57.4 p210 b2-a2 61 (24) 39.3 p210 b2-a3 1 1.6 p190 e1-a2 1 1.6

Quimerismo Molecular en TMO 12 TMO monitoreados: 9 hemopatías malignas 3 hemopatías no malignas Resultados al mes: QC: 9 No quimera: 2 QM: 1 (que posteriormente pasó a QC).

Resumen de los resultados de nuestro Dpto. Aproximadamente 100 publicaciones. 3 Premios del Concurso del Minsap 3 Tesis de Doctorado 15 TTR de residentes de Hematología 1 TTR de un residente de Genética Médica 8 Trabajos de Diploma de la Universidad Varios cursos nacionales e internacionales.

Perspectivas Futuras

¿Qué se está haciendo en el Mundo ahora? RT-PCR cuantitativo Estudio del Transcriptoma Estudio del Proteoma Terapia Molecular Dirigida

RT-PCR cuantitativa Gran importancia en el seguimiento de la LMC. La importancia en LPA está aún por determinarse. En LLA, el resultado de la RT-PCR cuantitativa al final de la inducción y al finalizar la consolidación determina el riesgo: alto intermedio bajo

Progresión del Genoma al Proteoma Proteoma + Transcripción Transcriptoma (variantes de empalme) ARNm Perfil de la expresión génica (Microarray analysis) Traducción Proteína Proteoma Análisis del proteoma (Proteomics) Modificaciones post-traduccionales + Interacción con otras proteínas Funciones

Transcriptoma Es el conjunto de ARNm expresados en una célula o tejido en un momento dado. Permite identificar subclases moleculares que no se pueden detectar por técnicas convencionales. Puede ayudar en el diagnóstico. Permitirá conocer el mecanismo de resistencia a las drogas. El objetivo futuro es caracterizar la célula madre para eliminar el clon neoplásico en su origen.

Proteoma Representa la población de proteínas en una célula o tejido en un momento dado. Detecta la localización, las modificaciones post-traduccionales, interacciones y recambio de las proteínas. Es a nivel del proteoma que el gen ejerce su función. Ofrece una mejor comprensión del estado fisiológico y patológico de un organismo.

Desventajas Transcriptoma Proteoma No detecta modificaciones post-traduccionales ni las interacciones entre las proteínas. Existen diferencias entre la vida media de los ARNm y la vida media de las proteínas. Proteoma Las técnicas son complejas. No puede detectar proteínas en poca cantidad. No puede hacer un análisis en una sola célula.

TERAPIA MOLECULAR DIRIGIDA Cada día se conocen nuevos mecanismos moleculares en la patogenia de las leucemias. Esto ha permitido que se desarrollen terapias moleculares dirigidas contra una mutación específica. Ejs. ATRA en LPA Glivec en LMC Inhibidores del FLT3 El objetivo futuro es mejorar la terapia molecular y lograr que llegue a ser una terapia personalizada según el genotipo de cada paciente.