TÉCNICAS LUMINISCENTES Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 TEMA 9 TÉCNICAS LUMINISCENTES

CONTENIDOS Introducción Teoría de la Fluorescencia y Fosforescencia Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CONTENIDOS Introducción Fluorescencia, Fosforescencia, Quimioluminiscencia Características analíticas Teoría de la Fluorescencia y Fosforescencia Tipo de espectros Variables que afectan a la Fluorescencia Fluorescencia y estructura Fluorescencia y entorno químico Fluorescencia y concentración Instrumentación Aplicaciones al análisis de alimentos

A A* A + hδ Métodos luminiscentes moleculares Fluorescencia Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción Métodos luminiscentes moleculares Basados en la emisión de radiación electromagnética por moléculas que previamente han sido excitadas. Cada especie A emite radiaciones de λ características Análisis cualitativo La intensidad de la radiación IF es proporcional a la [A] Análisis cuantitativo Análisis cualitativo Espectro de emisión A A* A + hδ En este tema se consideran tres tipos de métodos ópticos relacionados entre sí: Métodos Fotoluminiscentes: Fluorescencia y fosforescencia molecular Quimioluminiscencia. En todos ellos, las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo. Los métodos se conocen colectivamente como procedimientos luminiscentes moleculares. Fotoluminiscencia: Fluorescencia y Fosforescencia • La excitación se consigue mediante la absorción de fotones. • La fluorescencia presenta una vida corta, cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5s). • Fosforescencia: la radiación se mantiene durante un tiempo fácilmente detectable, después de haber acabado la irradiación a menudo varios segundos o más. • La emisión fotoluminiscente, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, es de mayor longitud de onda que la radiación utilizada para su excitación. Quimioluminiscencia • La quimioluminiscencia, se basa en el espectro de emisión de una especie excitada que se forma en el curso de una reacción química entre el analito y un reactivo adecuado. Análisis Cuantitativo Absorción de fotones (hδ ) Reacción química Fluorescencia Fosforescencia Quimioluminiscencia

El agua tónica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción La fluorescencia es un fenómeno que fue conocido en el siglo XIX por Stoke: observó fluorescencia en el mineral de fluorita . Excitación Emisión Luz λ mayor Luz UV Fig. 1 El agua tónica es un refresco carbonatado aromatizado con quinina. La quinina es un alcaloide de sabor amargo que se extrae de la corteza del árbol de la quina, y tiene propiedades antipiréticas, analgésicas y contra la malaria. La quinina es una sustancia fluorescente Agua tónica Bajo luz del sol Fig. 2 Bajo luz ultravioleta

Características analíticas Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 1. Introducción Características analíticas Características Sensibilidad (ppb) Gran intervalo lineal Selectividad Menor aplicabilidad que los métodos de absorción Mayor interferencia ambiental La fluorescencia es un proceso de fotoluminiscencia en el que los átomos y moléculas se excitan con la absorción de la radiación electromagnética. • La especie excitada se relaja al estado fundamental y emite su exceso de energía como fotones. • La característica más atractiva de la fluorescencia molecular es su sensibilidad inherente, habitualmente de uno a tres órdenes de magnitud mayor que con la espectroscopia de absorción. • Otra ventaja de los métodos de fluorescencia es su amplio intervalo de concentración lineal, significativamente mayor que en la espectroscopia de absorción. • Sin embargo, los métodos de fluorescencia tienen menos aplicaciones que los métodos de absorción, dado el número relativamente limitado de sistemas químicos que presentan fluorescencia apreciable. • Además, esta última se ve sujeta a muchos más efectos de interferencia ambiental que los métodos de absorción.

A + hδexcitación A* A + hδemisión Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia A + hδexcitación A* A + hδemisión hδexcitación hδemisión λexcitación λemisión E1 hδexcitación hδemisión E0 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia. Estado singlete fundamental excitado Estado triplete Estado electrónico molecular singlete: los espines de los e- están apareados Estado electrónico molecular triplete: los espines de los e- están desapareados Fluorescencia Fosforescencia

Estados singletes excitados Estados tripletes excitados Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Diagrama parcial de energía para un sistema fotoluminiscente Estados singletes excitados Estados tripletes excitados Cruce entre sistemas Fosforescencia T1 Fluorescencia Relajación vibracional Conversión interna S2 S1 Absorción excitación S0 Estado fundamental Energia λ2 λ1 λF λP

Velocidad de absorción y de emisión Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Velocidad de absorción y de emisión La velocidad a la que un fotón de radiación es absorbido es grande: el proceso requiere del orden de 10-14 a 10-15 s La emisión fluorescente, tiene lugar a una velocidad relativamente más lenta, entre 10-9 a 10-5 s, y depende inversamente de la absortividad molar del pico de absorción correspondiente al proceso de excitación La emisión fosforescente requiere tiempos del orden de 10-4 a 10 s ó más.

Procesos de desactivación Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 2. Teoría de la fluorescencia y de la fosforescencia Procesos de desactivación El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado Estado excitado FLUORESCENCIA: emisión de un fotón de radiación RELAJACIÓN VIBRACIONAL: no radiante CONVERSIÓN INTERNA: no radiante CONVERSIÓN EXTERNA: no radiante CRUZAMIENTO ENTRE SISTEMAS: no radiante FOSFORESCENCIA: emisión de un fotón de radiación Estado fundamental La fotoluminiscencia sólo la presentan un número relativamente pequeño de sistemas con características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación no radiantes sean mas lentos que los de emisión.

Emisión Fosforescente Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia y fosforescencia Espectro de excitación: Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia, manteniendo fija la λemisión y variando la λexcitación Espectro de emisión : Se obtiene al registrar la intensidad de fluorescencia manteniendo fija la λexcitación y variando la λemisión. Los análisis se efectúan seleccionando λexcitación y λemisión máximas. Fenantreno Excitación Emisión Fluorescente Emisión Fosforescente

Espectros de excitación y emisión de fluorescencia Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia Cada uno es una imagen especular del otro. Las emisión son mayores que excitación

a) espectro excitación b) espectro fluorescente Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 3. Tipos de espectros de fluorescencia y fosforescencia Espectros de excitación y emisión de fluorescencia Antraceno a) espectro excitación b) espectro fluorescente Cada uno es una imagen especular del otro

Sustancia fluorescente Intensidad de emisión fluorescente Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Estructura química Entorno químico Sustancia fluorescente Intensidad de emisión fluorescente

 = KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Rendimiento cuántico de fluorescencia:   = nº moléculas que emiten fluorescencia/nº total de moléculas excitadas  = nº fotones emitidos/nº fotones absorbidos  = KF / KF + Kces + Kce + Kci + Kpd + Kd K = las constantes de velocidad de los diversos procesos de desactivación posibles: fluorescencia (KF), cruce entre sistemas (Kces), conversión externa (Kce), conversión interna (Kci), predisociación (Kpd) y disociación (Kd ). Las variables que conducen a valores altos de KF y valores bajos del resto de velocidades exaltan la fluorescencia Rendimiento cuántico y tipo de transición: La eficacia cuántica es mayor para las transiciones -* KF, Kpd, Kd Estructura química Kces, Kce, Kci Entorno químico

Fluorescencia y estructura Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura Pueden presentar fluorescencia: Compuestos con estructuras con dobles enlaces altamente conjugados. Compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas La fluorescencia más intensa es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones π → π* de baja energía Fenantreno • La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución. • La eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con su grado de condensación Antraceno Fig. 1 Fig. 2

Fluorescencia y estructura Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura Heterociclos sencillos no fluorescentes Fusionados con anillos bencénicos sí presentan fluroescencia

Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes La sustitución en el anillo bencénico produce: Desplazamientos de la  de los máximos de excitación y emisión Un aumento o disminución de la intensidad de fluorescencia según el sustituyente

Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de los sustituyentes Los electrodonadores: -NH2, -NHR, -NR2, -OH, y –OR, aumentan la eficacia de la fluorescencia desplazándola a mayores l. Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO2, reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n-p *. Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia

Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y estructura. Efecto de la rigidez estructural  = 1 = 0,2 • La fluorescencia aumenta con la rigidez molecular. • La emisión fluorescente aumenta cuando los colorantes fluorescentes se adsorben en una superficie sólida ya que aumenta su rigidez: Indicadores de adsorción • La influencia de la rigidez también explica el aumento de la fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando forman complejos con iones metálicos. • Por ejemplo, la intensidad de fluorescencia de la 8-hidroxiquinoleína es mucho menor que la de su complejo de zinc

Temperatura Fluorescencia y entorno químico Disolvente Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y entorno químico Disolvente La fluorescencia de una molécula disminuye en presencia de disolventes que contengan átomos pesados: tetrabromuro de carbono, yoduro de etilo Temperatura Un aumento de temperatura provoca disminución de I F IF Temperatura ºC

pH Oxígeno disuelto Fluorescencia y entorno químico Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y entorno químico pH Influye en la fluorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo. Anilina Ión anilinio If = 20 IF = 0 Oxígeno disuelto Reduce la intensidad de fluorescencia de una disolución

Fluorescencia y concentración Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 4. Variables que afectan a la fluorescencia Fluorescencia y concentración La intensidad de emisión fluorescente (IF) es proporcional a la potencia radiante de la luz incidente (P0) y a la concentración de la especie fluorescente (c), si la absorbancia de la disolución es pequeña a las longitudes de onda de excitación y de emisión . IF = k P0 c IF = K c Análisis cuantitativo Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración Al aumentar P0 aumenta IF Análisis de trazas Para concentraciones de analito altas, IF deja de ser proporcional a c

Luminiscencia a muchas Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Instrumentación Esquema de un espectrofluorímetro Fuente de radiación Monocromador de excitación λexc Cubeta de muestra Una longitud de onda Luminiscencia a muchas longitudes de onda Muchas longitudes de onda Monocromador de emisión en ángulo recto λem Una longitud de onda Detector Registrador o PC Dispositivo de lectura

Fuente de luz Selección  ex y em Cubetas Detectores Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 5. Instrumentación De mayor potencia que las que se utilizan en absorción. La energía radiante emitida en fluorescencia es directamente proporcional a la intensidad de la fuente. Lámpara de arco de mercurio, Lámpara de arco de xenón, Láseres de N2 o de Ar Fuente de luz Selección  ex y em Filtros: fluorímetro Monocromadores : espectrofluorímetro Vidrio o cuarzo Rectangulares, con las cuatro caras pulimentadas Cubetas Detectores Tubos fotomultiplicadores.

Análisis cuantitativo Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones Análisis cualitativo Poca aplicación. la fluorescencia es valiosa en la identificación de derrames de petroleros. Análisis cuantitativo La aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales Los métodos fluorescentes son : Aplicables a intervalos de concentración más bajos los de absorción Tienen sensibilidades mayores que los métodos de absorción. •Tienen una precisión y exactitud menor que las de los de absorción. •Muy selectivos, con una selectividad mayor que los métodos de absorción.

Análisis cuantitativo Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones Análisis cuantitativo Se han desarrollado métodos cuantitativos basados en fluorescencia para especies inorgánicas, orgánicas y bioquímicas. Determinación de especies inorgánicas Los indirectos, basados en la disminución de la fluorescencia, quenching, como resultado de la interacción del analito con un reactivo fluorescente. Se utilizan para aniones y determinación de oxígeno en disolución. Los basados en la reacción del analito con un agente de complejación para formar un complejo fluorescente. Se utilizan para cationes • Determinación de Al (III) El granate de alizarina R permite detectar Al3+ a niveles de 0,007 µg/mL. GAR + Al (III) GAR - Al (III) Determinación de anión F-, se basa en la desactivación de la fluorescencia del complejo GAR - Al (III) GAR - Al (III) + F- GAR + Al(III)-F

Análisis cuantitativo Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones Análisis cuantitativo Determinación de sustancias orgánicas y bioquímicas El número de aplicaciones de los métodos fluorimétricos a problemas orgánicos es muy elevado Pueden determinarse por fluorescencia los aminoácidos, proteínas, coenzimas, vitaminas, ácidos nucleicos, alcaloides, porfirinas, esteroides, flavonoides, la adenina, ácido antranílico, hidrocarburos policíclicos aromáticos, cisteína, guanina, isoniazida, naftoles, ácido salicílico, triptófano, ácido úrico y numerosos metabolitos. • También muchos agentes medicinales pueden determinarse por fluorimetría, como la adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina y dietilamida del ácido lisérgico (LSD). • La aplicación más importante de la fluorimetría corresponde al análisis de productos alimenticios, sustancias farmacéuticas, muestras clínicas y productos naturales.

Aplicaciones al análisis de alimentos Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 6. Aplicaciones Aplicaciones al análisis de alimentos • Determinación de cationes y aniones • Determinación de quinina • Determinación de colorantes • Determinación de pesticidas • Determinación de vitaminas

CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS Asignatura: Análisis Químico Grado: Ciencia y Tecnología de los Alimentos Curso académico: 2012/13 CRÉDITOS DE LAS ILUSTRACIONES – PICTURES COPYRIGHTS Logo encabezado páginas OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia. Dirección web: http://ocw.um.es.. Página 4. Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluoriteBerbes.jpg. Author: Didier Descouens. Página 4. Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Tonic_water_uv.jpg. Author: User:Splarka from en:wp Página 15, Fig. 1. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:Anthracene_acsv.svg&page=1. Author: Calvero. Página 15, Fig. 2. Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fenantrene.PNG.