FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR

Presentación del tema: "FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR"— Transcripción de la presentación:

1 FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR
Graciela M. Escandar

2 FLUORESCENCIA luz incandescente luz ultravioleta

3 FOSFORESCENCIA 1:00:00 1:00:30 1:10:40

4 So singlete singlete* triplete* RELAJACIÓN NO-RADIANTE LUMINISCENCIA
ABSORBANCIA S2 S2 S1 S1 So So singlete singlete* triplete*

5 Fluorescencia molecular
Es un proceso de fotoluminiscencia en que las moléculas se excitan por absorción de radiación electromágnética. La especie excitada posteriormente se relaja hasta el estado fundamental, con la liberación de su exceso de energía en forma de fotones

6 DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski)
CI RV S2 CS S1 T1 ENERGíA ABSORCIÓN F CE P S0 1 2 3 4

7 Factores que influyen en la señal fluorescente
tipo de transición concentración estructura LUMINISCENCIA EN SOLUCIÓN solvente pH temperatura apagadores químicos

8 Factores que influyen en la señal fluorescente
tipos de transición p* p p* n Compuestos aromáticos, estructuras con dobles enlaces conjugados, anillos aromáticos fusionados. Rigidez. Sustituyentes estructura C H2 bifenilo fluoreno

9 Factores que influyen en la señal fluorescente
Efectos generales y específicos solvente Su aumento, disminuye la intensidad de fluorescencia por aumento de probabilidad de conversión externa temperatura

10 Factores que influyen en la señal fluorescente
La fluorescencia de compuestos aromáticos con propiedades ácido-base es generalmente pH-dependiente pH N H + anilina ion anilinio apagadores químicos Apagamiento dinámico y estático

11 BANDAS DEL ESPECTRO F EXCITACIÓN EMISIÓN Corrimiento de Stokes l

12 BANDAS DEL ESPECTRO F RAYLEIGH F RAYLEIGH 2° orden RAMAN RAMAN

13 ANÁLISIS CUANTITATIVO
 = No fotones emitidos/No fotones absorbidos  = IF/IA IF =  IA = =  (Io – IT) = =  Io (1– IT/Io) = =  Io (1 – e-2.303bC) = IF =  Io (1 – e-kbC)

14 ANÁLISIS CUANTITATIVO
IF =  Io (1 – e-kbC) Recordando que: x x2 x3 1! 2! 3! si x es muy pequeño: e-x = 1-x + - 1 e-x = IF =  Io (1– 1 + kbC) = Io kbC IF = KC K

15 ANÁLISIS CUANTITATIVO
IF vs C (a bajas concentraciones de analito) F C IF = KC

16 ESPECTROFLUORÍMETRO monocromador fuente M atenuador del haz monocromador fotomultiplicador de muestra fotomultiplicador de referencia amplificador dispositivo de lectura

17 OBTENCIÓN DE ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN
F EXCITACIÓN EMISIÓN l 1) Obtención del espectro de absorbancia para determinar la longitud de onda de absorción 2) Fijar el monocromador de excitación a esta l y obtener el espectro de emisión 3) Fijar el monocromador de emisión a la l seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro de excitación.

18 Si kbC es grande (absorbancia  0.02) IF =  Io [kbc – (kbc)2 2 (kbc)3
CAUSAS DE DESVÍO DE LINEALIDAD IF =  Io (1 – e-kbC) Si kbC es grande (absorbancia  0.02) IF =  Io [kbc – (kbc)2 2 (kbc)3 6 ... - + ] F C Término lineal Lineal+cuadrático+cúbico Lineal+cuadrático

19 FILTRO INTERNO Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el perfil de los espectros de excitación y/o emisión Producido por el propio analito (alta concentración) Variación de potencia de luz incidente en el trayecto Autoapagamiento Autoabsorción Producido por otra sustancia - Sustancia que absorbe en la región de l de excitación o emisión del analito

20 FILTRO INTERNO Alta concentración: la emisión disminuye en el trayecto de la luz incidente Baja concentración: emisión uniforme Detección de la emisión Excitación Detección de la emisión

21 Curva de calibración de sulfato de quinina
ppm ppm F Linealidad Filtro interno Término cúbico o mayor