Métodos de cultivo Técnicas de aislamiento Mantenimiento y preservación de cultivos puros
Objetivos del análisis microbiológicos Que el alimento cumpla con las normas de higiene y seguridad impuestas por la dependencias oficiales. 2. Que se ajuste con las normas internas de la compañía o laboratorio , las cuales se identifiquen tanto nacional como internacionalmente. 3. Que las materias primas que ingresen a la industria alimentaria cumpla con las normas oficiales de sanidad y sean las pactadas con el productor. 4. Que garantice el mantenimiento de la higiene en la línea de proceso y los almacenes.
Dependiendo del alimento y su historial la selección del plan incluye uno o varios de los métodos siguientes: Estimación del número total de microorganismos. Estimación del número total de microorganismos indicadores. Estimación del número total de microorganismos productores de toxiinfecciones alimentarias y microorganismos patógenos transportados en los alimentos. Análisis de los productos metabólicos que el desarrollo de ciertos microorganismos agrega al alimento, como son las toxinas.
Para garantizar el estándar de calidad de los productos en su proceso, involucra el desarrollo de tres procedimientos importantes prevenir la contaminación de sus materias primas, equipo, personal y productos finales cumpliendo y vigilando los programas específicos de limpieza. 2. Prevenir el crecimiento de µorganismos naturales y formadores de toxinas o esporas en las materias primas y alimentos procesados. 3. Eliminar todos los µorganismos patógenos de las materias primas, línea de proceso, superficies y empaque; mediante la evaluación constante de los puntos críticos.
Los alimentos que serán sujetos a un análisis microbiológico debe seleccionarse bajo un método de muestreo que garantice la homogeneidad y la representatividad de la muestra. Además debe colectarse en cantidad suficiente para el programa de análisis seleccionado . Adicionalmente, las muestras deberán protegerse de la recontaminación y minimizar los cambios microbiológicos durante su transporte y manejo. Vidal Quintanar Reyna Luz. 2005. fundamentos de análisis microbiológicos de alimentos. AGT Editor. Primera edición. México. (Muestreos: Colección y preparación).
Importancia del cultivo de microorganismos: Obtención de cultivos puros. Análisis morfológico, fisiológico, genético y otras características. Producción. Conteo de colonias (UFC)
¿Qué condiciones requiere el crecimiento microbiano? medio de cultivo: Una solución acuosa con los nutrientes y factores de crecimiento necesarios. Los μorganismos crecen en un medio de cultivo artificial se requieren condiciones como: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno asi como un grado correcto de acidez o alcalinidad .
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Según su estado físico Líquidos Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. Sólidos Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Según la naturaleza de sus constituyentes Medios naturales o complejos (Indefinidos) Están constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y usualmente se complementan con el añadido de minerales y otras sustancias. No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras. Medios sintéticos (químicamente definidos) Se preparan a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto, Se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales.
E. coli Medio definido Medio Complejo K2HPO4 7 g Glucosa 15 g KH2PO4 Extracto de levadura 5 g (NH4)2SO4 1 g Peptona MgSO4 0.1 g CaCl2 0.02 g Agua destilada 1000 ml 4-10 g pH 7 Elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo) 2-10 µg
3. Según sus propósitos de uso Medios de enriquecimiento Al cultivo en medio líquido que resulte en un incremento en el número de un tipo dado de μorganismo en relación con el número de otros tipos de μorganismos que puedan estar en el inoculo. Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del μorganismos que nos interesa o que inhiban el crecimiento de otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo de enriquecimiento no está determinada únicamente por la composición química, sino que puede ser variada significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH, fuerza iónica, iluminación, aireación etc.
Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del género Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o alimentos Adición de sangre, suero o extracto de tejidos de animales y plantas. Medios selectivos Se diferencian de los enriquecidos por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Ej. CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos, la adición de cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram+, utilizando maltosa como única fuente solo crecerán los que usen maltosa. El M110 para Staphylococcus, las cepas patógenas fermentan manitol y modifican el pH generando pigmentos en el medio
Morfología colonial en medios de aislamiento primario del cultivo Medio de cultivo Coloración de colonias Agar bismuto-sulfito verde-café sin brillo metálico Agar Hektoen rosado-salmón Agar Salmonella-Shigella rosadas Agar Tergitol 7 amarillas Agar MacConkey Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB) de Levine púrpura a verde metálico
Medios diferenciales Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Contienen indicadores de productos derivados de la actividad metabólica de los μorganismos sobre algunos de los componentes del medio. Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentación de carbohidratos.
Reacciones bioquímicas Estas pruebas se fundamentan con la actividad del sistema enzimático o metabólico, en demostrar si el µorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas.
Por ejemplo las bacterias entéricas Gram – forman un grupo grande y heterogéneo. Esta familia Enterobacteriaceae incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos. Los géneros clínicamente más importantes son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El género Escherichia, Enterobacter y Citrobacter, fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a diferencia de los géneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa
Demostración de la producción de Indol Aquí se empleó dos tubos con triptona y se inoculó los microorganismos Salmonella y Staphylococcus Aureus y se dejó incubado a 37 ºC por 24 horas y después a temperatura ambiente por 7 días. El tubo de S. Aureus dio positivo con color a rojo cereza, esto indica que este tipo de microorganismo es capaz de degradar al aminoácido tritófano formando un producto de hidrólisis de Indol. Bioquímicamente la Salmonella se caracteriza por no fermentar la lactosa y por no licuar la gelatina y por no producir Indol, aunque existen algunas excepciones. E. coli logró degradar la triptona y reaccionar para producir Indol, es decir dio positiva la prueba, el microorganismo Gram - a pesar de que se le consideraba susceptible, en este medio reaccionan sin ningún problema. No todos los microorganismos pueden realizar este rompimiento de triptona a indol, por lo cual esta reacción es de valor taxonómico.
Producción Alcohólica de Levadura En la levadura que realiza una fermentación alcohólica, como es el caso de cepas en tubo de ensayo “pasteurizado” produjo mayor fermentación ya que al someterlo al calor se inhibe el crecimiento bacteriano que no son de nuestro interés y al inocular levadura esta se desarrolla sin ninguna dificultad; lo que ocurrió en el tubo rotulado, no pasteurizado ya que aunque crecieran levaduras y la fermentación no fue completa, ya que parte de la glucosa allí existente fue consumida por los demás microorganismos.
Producción de H2S por los microorganismos Aquí se inoculó los microorganismos E. coli y Salmonella en un tubo de ensayo cada uno con agar inclinado. En el primer tubo con E. Coli no cambio color, dio negativo, no reacciono con el azufre o no es capaz de producir ácido sulfhídrico en un medio de aminoácido que contenga azufre, el microorganismos no se desarrolla en medio de O2 en este caso. Mientras que salmonella si desarrolló (en este medio con aminoácido) (H2S), esta prueba dio positivo. También hubo presencia del gas en medio de agar, este gas demuestra la presencia de (H2S). También el ennegrecimiento en la línea de siembra, nos indica que hubo producción de ácido sulfhídrico
Los sistemas comerciales más comúnmente usados son : Los sistemas comerciales más comúnmente usados son : * BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas. * API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana.
EJEMPLOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Medios de mantenimiento Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el crecimiento y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ej. Añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento
PREPARACIÓN DE MEDIOS Siempre preparar los medios con agua destilada (salvo el Marino). Es necesario ajustar siempre el pH. Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios. Los medios se preparan en matraces cónicos con tapa. Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o suspende en el agua. Se esteriliza a 121°C por 15 min Se espera a que enfríe (42°C o hasta que se pueda sostener el recipiente sin quemarse la mano). • Servir 20 ml Aprox. en cada caja de Petri
Métodos especiales de cultivo: Siembra en superficie sobre medio sólido Siembra en profundidad (vertido en placa) Dilución y solidificación en tubo Cultivo en células vivas Cultivo en animales Mycobacterium leprae
Siembra por estrías Dilución en serie
Técnica de las diluciones en serie Dilución Tipo de microorganismo 10-1 a 10-3 Hongos 10-4 a 10-6 Levaduras 10-7 a 10-10 Bacterias Para el aislamiento de microorganismos se puede aplicar la técnica de aislamiento por estría o por extensión en superficie (se trasfiere de 0.1 a 0.5 ml.)
Las recomendaciones generales para la preparación de la dilución son las siguientes: Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas de 10 ú 11 mL para muestras líquidas ó de 10 ú 11 g para muestras sólidas, en un recipiente o bolsa plástica estéril de tamaño adecuado. 2. Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente, el cual debe estar a una temperatura similar a la de la muestra. 3. Para preparar diluciones decimales adicionales, transferir 1 mL (o múltiplo) de la dilución primaria a otro recipiente que contenga nueve veces el volumen del diluyente estéril. Evitar el contacto entre la pipeta y el diluyente. 4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución. 5. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
6. Al homogeneizar la muestra en licuadora, stomacher, etc 6. Al homogeneizar la muestra en licuadora, stomacher, etc., operar el equipo 1 a 2 minutos, y nunca exceder 2.5 minutos. 7. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba abajo, en un arco de 30 cm, efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente, el cual debe estar a una temperatura similar a ésta. Evitar el contacto entre la pipeta y el diluyente. 8. Las diluciones de la muestra deben prepararse inmediatamente antes del análisis y usarse dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación para inocular el medio de cultivo. 9. Las muestras que van a ser analizadas deben almacenarse en condiciones adecuadas, para reducir al mínimo cualquier modificación en la población microbiana presente.
10. Utilizar utensilios estériles para introducir la muestra al recipiente o bolsa plástica, evitando tocar la superficie exterior. 11. Sanitizar el empaque de la muestra antes de abrirlo. 12. Verificar que no haya pérdidas significativas del volumen de los diluyentes durante el proceso de esterilización en autoclave. 13. Lavar correctamente el material reciclable. 14. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir en baño de agua de 40 a 45 °C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. Para muestras sólidas y semisólidas congeladas, descongelar en refrigeración de 4 a 8 ºC durante 18 horas y no más de 24 horas antes del análisis.
Mantenimiento y preservación de cultivos puros. Resiembra periódica en medios frescos. Depende de el medio de cultivo Temperatura propia para mantener los cultivos El tiempo de resiembra. Preservación de cultivos con una capa de aceite mineral. Para cultivos en agar inclinado el aceite deberá cubrir mas o menos 1.5 cm. Del pico de flauta del agar inclinado.
Mantenimiento y preservación de cultivos puros. Liofilización. Proceso utilizado para la eliminación de agua, mediante desecación al vacío y a muy bajas temperaturas. Almacenamiento a temperaturas muy bajas en presencia de agentes estabilizantes como glicerol, dimetilsulfóxido, nitrógeno líquido (-196ºC)