Células Asesinas Naturales Christian A. García Sepúlveda MD PhD Departamento de Hematología y Unidad de Trasplantes Hematopoyéticos Hospital Angeles Lomas

Introduccion Las células Asesinas Naturales (NK) son linfocitos citotoxicos del sistema inmune innato más grandes en volumen que los linfocitos B o T. No rearreglan receptores antígeno-específicos (como los linfocitos B (inmunoglobulinas) y Linfocitos T (Receptor de MHC). Se derivan de la médula ósea y constituyen aproximaddamente el 10% de los linfocitos circulantes (approx 64 células NK/mL).

Introduccion Inicialmente descubiertas por su capacidad para matar a células tumorales SIN SENSIBILIZACION PREVIA. Tienen dos funciones efectoras principales: Citotoxicidad celular Secreción de citocinas

Subpoblaciones NK Existen al menos dos subpoblaciones NK claramente definidas las cuales difieren en la densidad de expresión de CD56

Subpoblaciones NK POBLACION EFECTORA La mayoría de las células NK (90%) son CD56DIM y constituyen la población efectora responsable de 1.- CITOTOXICIDAD NATURAL 2.- CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS POBLACION EFECTORA

Subpoblaciones NK POBLACION DE RESERVA E INMMUNOREGULADORA En contraste, solamente el 10% de las células NK son CD56Bright y no poseen una importante actividad citolítica pero sí una grán capacidad proliferativa. 1.- CAPACIDAD PROLIFERATIVA 2.- PRODUCCION DE CITOCINAS POBLACION DE RESERVA E INMMUNOREGULADORA

Subpoblaciones NK POBLACION REGULADORA DE LA INVASION TROFOBLASTICA. RECIENTEMENTE SE HA DESCRITO UNA SUBPOBLACION DE CELULAS NK EN LA MUCOSA ENDOMETRIAL (CD56BRIGHT UTERINAS) EN LA CUAL CONSTITUYEN 70% DE LOS LEUCOCITOS PRESENTES Y SE ENCARGAN DE MODULAR LA INVASION TROFOBLASTICA. POBLACION REGULADORA DE LA INVASION TROFOBLASTICA.

Expresión de Receptores Fenotipicamente expresan moléculas de superficie CD56 (isoforma de una molécula de adhesión neural de función desconocida). Carecen del antígeno CD3 (característico de linfocitos T). Expresan otros tipos de receptores: Receptores de Dominios Lectina-símiles (CTLD) Receptores Inmunoglobulina-similes (KIR) Receptores de Citotoxicidad Natural (NCR)

Expresión de Receptores

Roles Biológicos Las células NK pueden realizar sus funciones a través de cuatro mecanismos distintos: 1.- Citotoxicidad Celular Mediada por Anticuerpos 2.- Citotoxicidad Natural 3.- Inmunorregulacion y produccion de citocinas 4.- Hipótesis “Missing Self” (Yo faltante).

Roles Biológicos CITOTOXICIDAD CELULAR MEDIADA POR ANTICUERPOS Resulta de la activación de las células NK por anticuerpos IgG dirigidos contra ciertos antígenos a través del receptor de Inmunoglobulinas (FcR) presente en la membrana de las células NK (CD16). Perforina NK C FcR Patógenos Granzima B Célula infectada

Roles Biológicos NK C No depende de restricción-CMH CITOTOXICIDAD NATURAL No depende de restricción-CMH Espontánea y sin sensibilización previa Depende del balance de estímulos activ/inhib y Receptores (NCR) antígenos activatorios Perforina NK C NCR antígenos inhibitorios Granzima B Célula tumoral

Molécula del CMH clase I Roles Biológicos MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” ausente. “Las células NK eliminan a células que han perdido o disminuido la expresión de moléculas del CMH en su superficie debido a incursiones microbianas u oncogénicas.” Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de antígenos propios (CMH). C Inmunotolerancia Célula Normal

Molécula del CMH clase I Roles Biológicos MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” aussente. “Las células NK eliminan a células que han perdido o disminuido la expresión de moléculas del CMH en su superficie debido a incursiones microbianas u oncogénicas.” Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de la ausencia de antígenos propios (CMH). C Aloreactividad Célula Tumoral/infectada

Molécula del CMH clase I Roles Biológicos MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” aussente. Esta hipótesis trabajo con la suposición de que existía un receptor inhibitorio capaz de realizar esta función. Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de la ausencia de antígenos propios (CMH). C Aloreactividad Célula Tumoral/infectada

Molécula del CMH clase I Roles Biológicos Los “receptores inhibitorios capaces de reconocer a moléculas del CMH de clase I” ulteriormente fueron caracterizados y denominados: Receptores Inmunoglobulina-Similes de Células Asesinas Naturales [Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors (KIR)] KIR Molécula del CMH clase I NK C

KIR BREVEMENTE, Tienen versiones de dos o tres dominios y pueden poseer regiones intracelulares cortas (de activación) y largas (de inhibición).

KIR NOMENCLATURA, Acronimo KIR2DL1*0030202 Nombre de un alelo

KIR NOMENCLATURA, Dos dominios KIR2DL1*0030202 Nombre de un alelo

Región intracelular larga KIR NOMENCLATURA, Región intracelular larga KIR2DL1*0030202 Nombre de un alelo

KIR2DL1*0030202 KIR NOMENCLATURA, Nombre de un alelo Primer proteina KIR de dos dominios y región intracelular larga descubierta KIR2DL1*0030202 Nombre de un alelo

Olvidemos esto por el momento… Semejante a la nomenclatura del HLA KIR NOMENCLATURA, Olvidemos esto por el momento… Semejante a la nomenclatura del HLA KIR2DL1*0030202 Nombre de un alelo

KIR BREVEMENTE, Reconocen a CMH igual que el TCR pero de una manera no restricta (sin importar mucho el tipo de péptido presentado).

KIR GENETICA, Son polimórficos: Existen 17 genes, Más de 99 alelos y Múltiples haplotipos.

Roles Biológicos Estos mecanismos le permiten a las células NK llevar a cabo las siguientes funciones inmunes importantes: 1.- Vigilancia y participación en respuestas anti-tumorales 2.- Participar en reacciones contra patógenos. 3.- Influir sobre la fisiología de la implantación. 4.- Inmunoregulación e inmunotolerancia 5.- Elementos importantes en la biología de los TCPH.

Roles Biológicos Participación en reacciones contra patógenos. Las células NK han demostrado jugar un papel muy importante en una grán gama de incursiones microbianas. Particular importancia en infecciones virales o por patógenos bacterianos intracelulares. Las raras deficiencias de células NK o de su función se acompañan de infecciones virales y bacterianas y en menor grado de infecciones fúngicas.

Roles Biológicos Las células NK pueden participar en respuestas inmunes contra patógenos microbianos de diversas maneras (4 basicas). Célula infectada Célula NK Sobre-expresión de moléculas de estrés Expresión de moléculas del CMH Expresión de antígenos microbianos

Roles Biológicos Modulación de la implantación embrionaria. Las células NK han demostrado la capacidad de modular el grado de invasión endometrial del trofoblasto durante el primer triméstre del embarazo. Las células NK endometriales expresan altas densidades de receptores (KI2DL4) específicos para alotipos de HLA expresados en alta densidad por el trofoblasto (HLA-G). Algunos fenotipos de células NK endometriales han sido vinculadas por algunos estudios a incrementos de la incidencia de abortos espontáneos e incluso asociados a pre-eclampsia (otros resultados son ambiguos).

Roles Biológicos Inmunoregulación e Inmunotolerancia. Papel fundamentado practicamente en dos hallazgos: 1.- La capacidad potencial que supone la presencia de receptores inhibitorios sobre la superficie de un linfocito que puede secretar citocinas inmunomoduladoras. 2.- El papel de inmunotolerancia exhibido por las células NK uterinas las cuales logran un balance perfecto entre el grado de invasión permitido a un tejido alogénico (trofoblasto) y un embarazo necesario para la procreación de la especie (mientras se tolera la generación, presencia y perpetuación de la biodiversidad de las especie).

Roles Biológicos Inmunoregulación e Inmunotolerancia (KIR). Se ha demostrado la presencia de células T CD4+CD28nulas que expresan KIR2DS2 en las lesiones endoteliales de pacientes con artritis reumatoide. Se cree que las interacciones del KIR2DS2 con su ligando HLA-C en ausencia del receptor inhibitorio KIR2DL2 favorece la aloreactividad de las células T que expresan este KIR y la lesión autoinmune de células NK. Otras asociaciones descritas: KIR2DS2 en artritis psoriásica

Roles Biológicos Papel en Trasplantes Hematopoyéticos. Las células NK constituyen la primera población de linfocitos del donador en injertar. Durante los primeros 3 meses constituyen el 80% de los linfocitos circulantes. Aproximadamente 70% de las células NK presentes durante los primeros 3 meses post-trasplante son CD56Bright productoras de citocinas de rápida proliferación.

Reconstitución Inmune # Leucocitos NK T CD8 B 1 3 6 9 12 Período de recuperación numérica Régimen de acondicionamiento Reconstitución inmune Período de Neutropenia

Reconstitución Inmune NK La reconstitución inmune depende de la habilidad del injerto para generar células Mieloides y Linfoides de novo. Las primeras células en injertar son las del sistema inmune innato (NK, monocitos, granulocitos y macrófagos).

Reconstitución Inmune T CD8 B 1 3 6 9 12 En contraste, el número de linfocitos T y B permanece bajo durante meses y su función permanece “sub-optima” durante meses/años.

Establecimiento del Injerto La protección y vigilancia inmune durante los primeros meses postrasplante está a cargo de las células NK derivadas del donador. Las células NK también han demostrado contribuir y promover la sobrevivencia de precursores hematopoyéticos trasplantados cuando el receptor presenta quimerismo completo para las células NK del donador durante los primeros meses postrasplante. Otros estudios han demostrado una mayor incidencia de fracaso del injerto cuando no se logran niveles de quimerismo >75% para células NK del donador antes de los 20 días. Jacobs et al, 1992 Baron et al, 2004 Bornhauser et al, 2001

Establecimiento del Injerto Modelo de Resistencia Híbrida.

Papel en EIcH El modelo de la resistencia híbrida también explica por que las células NK no generan EIcH o el rechazo de trasplantes de órganos sólidos (no son del linaje hematopoyético. La restricción de la actividad citolítica postrasplante a células del linaje hematopoyético depende de la expresión de moléculas de adhesión por las células blanco (como el LFA-1). El hecho de que las células NK no reaccionen ante células somáticas (y por lo tanto no puedan dar inicio al EIcH) no impide su participación en reacciones de Injerto-contra-huesped iniciadas por otros linfocitos. Oertel et al, 2001 Schmidt et al, 1985; Barao et al, 2005 Acevedo et al, 1991

Papel en EIcH Recientemente algunos estudios han demostrado que la presencia de células NK del donador proteje al receptor de la EIcH: Las células NK parecen ser los mejores candidatos para explicar la baja tasa de EIcH en trasplantes de sangre de cordón umbilical. En éste escenraio de sangre umbilical, se cree que las células NK del donador son capaces de inducir la tolerancia al receptor o modular la actividad de las células presentadoras de antígenos del receptor. La sangre de cordón umbilical posee mayores cantidades de células NK que la sangre periférica o médula ósea de niños o adultos. Ruggeri et al, 1999 Chargui et al, 2000; Brahmi et al, 2001

Papel en GvL (Injerto vs tumor) Vigilancia y participación en respuestas anti-tumorales Inicialmente descubiertas por su capacidad para matar a células tumorales SIN SENSIBILIZACION PREVIA. La capacidad de las células NK para destruir células transformadas se describió tempranamente después de la caracterización de esta subpoblación de linfocitos. Originalmente se postuló la hipótesis del “yo faltante” para explicar estos acontecimientos. Heberman et al, 1975 Ljunggren & Karre, 1985

Papel en GvL (Injerto vs tumor) Hoy en día se cree que las células NK desempeñan su actividad de vigilancia y respuesta anti-tumoral mediante tres mecanismos distintos: Reconocimiento de la baja expresión de CMH a través de KIR’s Reconocimiento de antígenos tumorales a través de NCR’s Reconocimiento de señales de daño a través de CTLD’s

Expresión de Receptores

Fundamentos celulares MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” ausente. “Las células NK eliminan a células que han perdido o disminuido la expresión de moléculas del CMH en su superficie debido a incursiones microbianas u oncogénicas.” Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de antígenos propios (CMH). C Inmunotolerancia Célula Normal

Fundamentos celulares MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” ausente. “Las células NK eliminan a células que han perdido o disminuido la expresión de moléculas del CMH en su superficie debido a incursiones microbianas u oncogénicas.” Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de la ausencia de antígenos propios (CMH). C Aloreactividad Célula Tumoral/infectada

Fundamentos celulares MISSING SELF - Reconocimiento del “Yo” ausente. Esta hipótesis trabajo con la suposición de que existía un receptor inhibitorio capaz de realizar esta función. Receptor Inhibitorio de Moléculas del CMH clase I Molécula del CMH clase I NK = Reconocimiento de la ausencia de antígenos propios (CMH). C Aloreactividad Célula Tumoral/infectada

Fundamentos celulares Los “receptores inhibitorios capaces de reconocer a moléculas del CMH de clase I” ulteriormente fueron caracterizados y denominados: Receptores Inmunoglobulina-Similes de Células Asesinas Naturales [Killer Cell Immunoglobulin-like Receptors (KIR)] KIR Molécula del CMH clase I NK C

Fundamentos celulares Las implicaciones de ésta hipótesis fueron posteriormente descritas in vitro probando la actividad citotóxica de las células NK ante células tumorales expresando niveles normales y subnormales de moléculas del CMH clase I. Las células tumorales pueden perder o disminuir la expresión de moléculas del CMH como consequencia de: Inestabilidad genética y acumulo de mutaciones Virus oncogénicos Estrategias de evasión inmunes Disrupción de la maquinaria celular La pérdida o disminución de la expresión de moléculas del CMH es ventajosa para el tumor ya que le permite evadir la detección inmune mediada por linfocitos T citotoxicos. Piontek et al, 1985 Glaas et al, 2000

Fundamentos celulares No obstante, también se describieron casos en que las células NK presentaban aloreactividad en contra de células tumorales que expresaban niveles normales de moléculas del CMH… Posteriormente se descubrió que las células NK también expresaban receptores específicos para antígenos tumorales llamados Receptores desencadenantes de la Citotoxicidad Natural (Natural Citotoxicity triggering Receptors o NCR’s). Nishimura et al, 1988; Leiden et al, 1989; Pena et al, 1990 Sivori et al, 1997; Vitale et al, 1998; Pende et al 1999

NCR’s NK C No depende de restricción-CMH CITOTOXICIDAD NATURAL No depende de restricción-CMH Espontánea y sin sensibilización previa Depende del balance de estímulos activ/inhib y Receptores (NCR) antígenos activatorios Perforina NK C NCR antígenos inhibitorios Granzima B Célula tumoral

Señales de daño (p.ej. HSP-60) CTLD’s RECONOCIMIENTO DE SEÑALES DE DAÑO Mediada por Receptores de Dominios Lectina-C-similes Reconocen señales de daño constantes u oligomórficas Señales de daño (p.ej. HSP-60) Perforina NK C CTLD Granzima B Célula tumoral

Evidencia Clínica Se ha demostrado que las células NK son capaces de reconocer y eliminar células transformadas de diversos linajes tumorales tanto in vitro como in vivo ( post-TCPH). Smyth et al. 2000; Basse et al. 2001; Gansuvd et al. 2002 Las células NK han demostrado participar activamente en la erradicación de Enfermedad Mínima Residual post-TCPH. Garrido et al. 1995; Seliger et al. 2002; Chang et al. 2003 La actividad anti-tumoral en contra de una grán variedad de células tumorales de linaje hematopoyético (LMC, LMA y LLC) ha sido demostrada in vitro NK. Ruggeri et al. 2002; Hu 2003; Costello et al. 2004

Evidencia Clínica (Ruggeri et al, 1999) 60 Pacientes con leucemia sometidos a TCPH haploidéntico: 22 con LLA 25 con LMA 13con LMC Clasificados en tres grupos dependiendo del potencial de aloreactividad mediado por KIR’s que exhibian sus células NK (basado en tipificación del HLA) Potencial para aloreactividad en el sentido Injerto-contra-huesped Potencial para aloreactividad en el sentido huesped-contra-injerto Sin aloreactividad de células NK

Evidencia Clínica (Ruggeri et al, 1999) Este estudio demostró que los trasplantes con aloreactividad de células NK en dirección Injerto-contra-huesped poseían una ventaja biológica sobre los otros trasplantes en forma de un mayor efecto injerto-contra-tumor. La tasa de recaidas en este grupo fue menor que para los otros grupos de aloreactividad potencial. No obstante este efecto solo se observó cuando se trataba de pacientes con tumores mieloides y no en los que poseian tumores linfoides (diferencia que se suponía dependía de la expresión de moléculas de adhesión).

Futuro de las células NK en TCPH A pesar de que las células NK han demostrado jugar un papel interesante en TCPH haploidénticos su rol en modalidades de trasplante más comunes como alogénicos HLA compatibles relacionados o nó aun queda por sser demostrado. Constituyen el próximo paso en inmunoterapia adoptiva… la infusión de células NK del donador tiene la capacidad de brindar la ventaja de incrementar las reacciones contra tumor/leucemia sin incrementar la incidencia de EIcH. Aun no se ha comprobado con estudios grandes (multicéntricos) y poblaciones homogéneas de pacientes y donadores la utilidad clínica de tipificar y buscar la compatibilidad o incompatibilidad de receptores KIR o sus ligandos.

Futuro de las células NK Algunos temas que merecen seguimiento: Rol de las células NK en padecimientos autoinmunes Rol de las células NK en la biología de la implantación Rol de las células NK como inmunoterapia adoptiva Rol de las células NK en susceptibilidad/resistencia a infecciones Rol de las células NK en susceptibilidad/resitencia al desarrollo de ciertos tumores.

GRACIAS Christian A. García Sepúlveda MD PhD Claudia Monreal Alcántara MD Rosa María Jiménez Alvarado MD Roberto Ovilla Martínez MD Departamento de Hematología Unidad de Trasplantes Hematopoyéticos Hospital Angeles de las Lomas