CONCEPTOS BÁSICOS DE INMUNOLOGÍA PARA BIOTECNÓLOGOS Dario C. Ramirez Dr en Bioquímica & Magister en Inmunología Contacto: Laboratorio de Medicina Experimental y Terapéuticas Cátedra de Genética Molecular E-mail: ramirezlabimibiosl@ymail.com / moleculargenetics.unsl@gmail.com Facebook: ramirezlabimibiosl Introducción a la Biotecnología - Licenciatura en Biotecnología 2014

Overview 1- Breve reseña historica y conceptos de inmunología 2- El sistema inmunológico 3- Anticuerpos o inmunoglobulinas 4- La respuesta inmunológica 5- Antígenos, hapteno, adyuvantes e inmunogenos 6- Anticuerpos policlonales/monoclonales 7- Marcado de anticuerpos 8- Interacción antigeno-anticuerpo 9- Vacunas y Técnicas inmunoquímicas 10- Aplicaciones de los inmunoreactivos en biotecnología

Orígenes de la Inmunología El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el médico inglés Edward Jenner (1749-1823) en la imagen superior, tras su constatación de que las tamberas que habían adquirido la viruela de la vaca o vacuna (una forma benigna de enfermedad que sólo producía pústulas en las manos) no eran atacadas por la grave y deformante viruela humana. En 1796 inoculó a un niño, fluido procedente de las pústulas vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad. El primer abordaje se debió a Louis Pasteur (imagen inferior). Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de cultivos viejos y poco virulentos de esa bacteria, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados.

CONCEPTO DE INMUNIDAD INMUNIDAD Reacción frente a sustancias extrañas, incluido microorganismos y macromoléculas como proteínas y polisacáridos, sin implicar las consecuencias fisiológicas o patológicas de tal reacción. LA INMUNOLOGÍA es el estudio de la Inmunidad en su sentido amplio y de los acontecimientos celulares y moleculares que se producen después que nuestro organismo se encuentra con microorganismos u otras moléculas extrañas.

El sistema inmunológico

Vías de Ingreso de los Antígenos

Células del Sistema Inmune

Mecanismos de Defensa Inespecíficos y Específicos

CARACTERISTICAS DE LOS MECANISMOS INMUNIDAD NATURAL INMUNIDAD ESPECIFICA Están presentes antes Son inducidos por la ex- de la exposición posición No aumentan con las Aumentan con cada exposiciones exposición Son inespecíficos Son exquisitamente específicos Hay memoria inmunitaria Amplifica los mecanismos de la inmunidad natural

Anticuerpos policlonales y monoclonales

La respuesta inmunitaria humoral está mediada por moléculas de anticuerpo que secretan las células plasmáticas

Inmunoglobulina o anticuerpo

Isotipos de inmunoglobulinas

PROPIEDADES DE LAS INMUNOGLOBULINAS Estructura y características fisico-químicas Funciones efectoras

La respuesta inmunológica: Producción de anticuerpos

CARACTERISTICAS DE LA RESPUESTA INMUNE ESPECIFICIDAD DIVERSIDAD MEMORIA AUTOLIMITACION DISCRIMINACION ESPECIALIZACION

ANTÍGENO Y ADYUVANTE Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos. Es capaz de despertar una respuesta inmunitaria en un individuo inmunologicamente competente. El antígeno puede ser el propio agente (bacterias o virus), fragmentos de él (flagelos, fimbrias), o proteínas y polisacáridos de su superficie.

HAPTENO + CARRIER = INMUNOGENO HAPTENOS Moléculas incapaces de inducir una respuesta inmune por sí solas , no obstante si se asocia con otra molécula llamada portadora (carrier) logran inducir la producción de anticuerpos. Suelen ser moléculas proteicas de bajo peso molecular o moléculas químicas no proteicas. La respuesta inmunitaria puede llevar a la producción simultánea de anticuerpos contra el hapteno y contra el carrier. HAPTENO + CARRIER = INMUNOGENO

CARACTERISTICAS ASOCIADAS CON LA INMUNOGENICIDAD Y CANTIDAD DE INMUNOGENO La producción de una adecuada respuesta inmune requiere una determinada concentración del antígeno: muy pequeñas cantidades o grandes cantidades pueden alterar la respuesta inmune: Pequeñas cantidades inoculadas repetidamente pueden inducir tolerancia. Grandes cantidades de antígeno pueden dar lugar a parálisis inmunológica.

Inmunoglobulina = anticuerpo

No todos los anticuerpos son Gammaglobulinas Inmunoglobulina No todos los anticuerpos son Gammaglobulinas

Producción de anticuerpos policlonales Modelos animales para la producción de anticuerpos

Anticuerpos monoclonales Anticuerpos idénticos que se unen con un EPITOPE específico y son producidos por un tipo de linfocito B híbrido inmortal con capacidad ilimitada de producción. Anticuerpos Monoclonales Importante avance para inmunología.

Anticuerpos monoclonales Anticuerpos idénticos que se unen con un antígeno específico y son producidos por un tipo de linfocito B híbrido inmortal con capacidad ilimitada de producción.

Anticuerpos policlonales vs anticuerpos monoclonales Mayor homogeneidad. Reproductibilidad de sus efectos, como consecuencia de su homogeneidad. Mayor capacidad potencial de seleccionar los mejores anticuerpos en afinidad, tipo de reconocimiento. Ventajas sobre Anticuerpos Policlonales Monoclonal Mouse or rabbit hybridoma Tends to be ‘cleaner’ Very consistent batch-to-batch More likely to get false negative results Polyclonal Many different species Tends to have more non-specific reactivity Can have very different avidity/affinity batch-to-batch More likely to have success in an unknown application

Inmunoreactivos derivados de los anticuerpos http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_monoclonal_antibodies

Aplicaciones biotecnológicas de los anticuerpos monoclonales Identificación de Marcadores Fenotípicos Distintivos de Tipos Celulares Concretos. Inmunodiagnóstico (Inmunoanálisis). Diagnóstico y Monitoreo (vitaminas, drogas, hormonas, citocinas, enfermedades, marcadores tumorales, enzimas). Tratamiento (Artritis Reumatoide, Leucemias de Linf. B, Cáncer de Mama, de Cólon). Análisis Funcional de Moléculas de Superficie y Secretadas. Catálisis Biosensores (moléculas orgánicas e inorgánicas).

INTERACCION ANTIGENO - ANTICUERPO Especificidad y reversibilidad

Los antígenos (EPITOPES) pueden unirse a cavidades, hendiduras o superficies extendidas en el sitio de unión de las moléculas de anticuerpo (PARATOPE)

FUERZAS NO COVALENTES QUE MANTIENE UNIDO EL ANTIGENO AL ANTICUERPO

Antígenos vs epitopes

Factores de Interacción Reversible AFINIDAD Fuerza de unión entre una zona de fijación de un anticuerpo y un epítopo de un antígeno. Factores de Interacción Reversible Kd Normal 10-7 y 10-11 M Fuerzas electrostáticas Puentes de H Fuerzas de van der Waals Interacciones Hidrófobas Kd = concentración de Ag. Necesaria para ocupar sitios de unión de ½ de anticuerpos en solución.

Fuerza de unión entre anticuerpo con todos los epítopos disponibles. AVIDEZ Fuerza de unión entre anticuerpo con todos los epítopos disponibles. Zona de Equivalencia Zonas de Exceso Incremento de concentración de Ag. o de Ac. en medio de forma que aquellos en estado libre desplacen a los unidos. Concentración a la cual Ag. y Ac. forman inmunocomplejos con puentes entrecruzados de manera que se encuentren acopladas en grandes masas. Muchas funciones efectoras ocurren de forma óptima cuando >2 Ac. se encuentran cerca y unidos a Ag. polivalente.

ESPECIFICIDAD Reconocimiento Reacción Cruzada Capacidad de reconocer Ag. al distinguir con precisión un solo epítopo específico del Ag. Reconocimiento Reacción Cruzada Reacción que se establece entre un epítopo y el Ac. específico para otro Ag. estructuralmente relacionado. Distinción entre 2 epítopos lineales que difieren sólo en la sustitución de un AA con poco efecto en estructura 2ria. Permite que los Ac. generados no reaccionen normalmente con moléculas del propio organismo o Ag. de otro origen. Enfermedades Autoinmunes

Presencia de gran número de Ac. que se unen a diferentes Ag. DIVERSIDAD Presencia de gran número de Ac. que se unen a diferentes Ag. Repertorio de Ac. Mecanismos Genéticos Recombinación aleatoria de ADN  Genes funcionales  Regiones V de cadenas Adición aleatoria de nucleótidos  Recombinación V Totalidad de Ac. con diferentes especificidades que posee un individuo. Variaciones estructurales se concentran en regiones hipervariables de las cadenas, determinando especificidad.

USO DE LOS INMUNOREACTIVOS VACUNAS TECNICAS INMUNOQUIMICAS

VACUNAS

Inmunización mediante las Vacunas La Inmunización es la técnica de medicina preventiva cuyo objetivo consiste en procurar resistencia inmune frente a un organismo infeccioso. Con este fin, se inocula al individuo una forma del organismo patógeno que no tiene capacidad de producir la enfermedad, pero si de inducir la formación de anticuerpos. Este proceso se denomina también vacunación debido a que la primera técnica de inmunización consistió en la administración del virus de la viruela vacuna para lograr la inmunidad frente a la viruela. El preparado inmunizante se introduce en el organismo a través de la piel (inoculación), salvo algunas excepciones, como la vacuna oral de la polio tipo Sabin. La duración del efecto protector es muy variable, desde seis meses en el caso de la peste hasta diez años para la fiebre amarilla. Las vacunas son la forma más eficaz de protección frente a los agentes patógenos contra los que los antibióticos no son eficaces, por ejemplo los virus. En los países occidentales se administran ciertas vacunas de acuerdo a un calendario oficial de vacunación. Las vacunas se preparan con microorganismos muertos por la exposición al calor o a agentes químicos (como la primera vacuna de la polio desarrollada por Jonas Salk, en la imagen superior, o la vacuna de la fiebre tifoidea); con un toxoide, forma inactivada de la toxina producida por el microorganismo (vacunas del tétanos y la difteria) o con un virus “vivo” atenuado, es decir, un virus debilitado en el laboratorio de manera que no produzca la enfermedad (como la vacuna de la polio desarrollada por Albert Sabin (en la imagen inferior), o las vacunas del sarampión y la fiebre amarilla).

Las Vacunas Una Vacuna es un preparado de antígenos procedentes de microorganismos patógenos, cuya finalidad es la creación de anticuerpos que reconozcan y ataquen a la infección y, por lo tanto, produzcan la inmunidad del organismo inoculado. La vacuna suele consistir en dosis muy pequeñas del propio agente (forma inactiva o atenuada) que origina la enfermedad, por lo que provoca la creación de anticuerpos que permanecen en el organismo y lo protegen en el caso de futuros contagios. La técnica de administración depende del tipo de vacuna; la más común es la inoculación, pero en algunos casos es la ingestión o el spray nasal.

Los Sueros La inmunidad artificial pasiva se adquiere cuando al sujeto se le administra directamente anticuerpos específicos para un patógeno determinado. Los anticuerpos producen inmunidad rápidamente (unas pocas horas), pero su efecto no es de larga duración (sólo unos meses), debido a que no se activa la memoria inmunológica. Estos anticuerpos reciben el nombre de suero o antídoto. Este tipo de sueros se utilizan para inmunizar contra el tétanos, la difteria, la hepatitis (A y B), etc. .

TIPOS TRADICIONALES DE VACUNAS Inactivadas: microorganismos dañinos que han sido tratados con productos químicos o calor y han perdido su peligro. Ejemplos de este tipo son: la gripe, cólera, peste bubónica y la hepatitis A. La mayoría de estas vacunas suelen ser incompletas o de duración limitada, por lo que es necesaria más de una toma. Vivas atenuadas: microorganismos que han sido cultivados expresamente bajo condiciones en las cuales pierden sus propiedades nocivas. Suelen provocar una respuesta inmunológica más duradera, y son las más usuales en los adultos. Por ejemplo: la fiebre amarilla, sarampión o rubéola (también llamada sarampión alemán) y paperas. Toxoides: son componentes tóxicos inactivados procedentes de microorganismos, en casos donde esos componentes son los que de verdad provocan la enfermedad, en lugar del propio microorganismo. En este grupo se pueden encontrar el tétanos y la difteria. Subunitarias: introduce un microorganismo atenuado o inactivo, dentro del sistema inmunitario, para crear una respuesta inmunitaria. Un ejemplo característico es la vacuna subunitaria contra la hepatitis B, que está compuesta solamente por la superficie del virus (superficie formada por proteínas).

NUEVOS TIPOS DE VACUNAS Conjugadas: ciertas bacterias tienen capas externas de polisacáridos que son mínimamente inmunitarios. Poniendo en contacto estas capas externas con proteínas, el sistema inmunitario puede ser capaz de reconocer el polisacárido como si fuera un antígeno (un antígeno puede ser una proteína o un polisacárido). Vector recombinante: combinando la fisiología (cuerpo) de un microorganismo dado y el ADN (contenido) de otro distinto, la inmunidad puede ser creada contra enfermedades que tengan complicados procesos de infección. Vacuna de ADN: vacuna de desarrollo reciente, es creada a partir del ADN de un agente infeccioso. Funciona al insertar ADN de bacterias o virus dentro de células humanas o animales. Algunas células del sistema inmunitario reconocen la proteína surgida del ADN extraño y atacan tanto a la propia proteína como a las células afectadas.

TECNICAS INMUNOQUIMICAS Marcado de anticuerpos o sus fragmentos con fines diagnósticos o terapéuticos

Los inmunoensayos mas corrientes ELISA Western blot Immunoprecipitation Inmunopurificación Citometria de Flujo Immunohistochemistry …….

Inmunoprecipitación

Inmunopurificación

Citometría de flujo

Western blot, western blotting o inmunoblotting

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Slides by Mathias Bader and Simon Loew

ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA detects substances with antigenic properties (mainly proteins) Based on enzymatic color-reaction

Basic principle of ELISA Enzyme is used to detect the binding of Antibody - Antigen Enzyme converts colorless substrate into colored product, indicating the presence of Antibody - Antigen complex ELISA can be used to detect either presence of Antigens or Antibodies

Direct and Indirect ELISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Direct ELISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Antibody is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antigen Specific antigen binds if contained

Remove test fluid and unbound antigen Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing

Remove test fluid and unbound antigen Binding of antigen is strong enough to withstand rinsing

Add enzyme labeled antibody Labeled antibody binds to antigens E E E E E E

Wash sample to remove unbound antibodies

Wash sample to remove unbound antibodies

Wash sample to remove unbound antibodies Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Add substrate Measure color change Positive Negativ E E E Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Direct and Indirect ELISA Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Indirect ELISA Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Slides by Mathias Bader and Simon Loew

Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody

Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Wash sample

Antigen is adsorbed onto microtiter plate Add serum to test for antibody Wash sample

Add secondary antibody Primary antibody binds to secondary anitbody E E E E E E

Add secondary antibody Wash unbound antibodies E E E E E E E E

Add secondary antibody Wash unbound antibodies E E E

Add secondary antibody Wash unbound antibodies E E E

Add substrate Measure color change Positive Negativo E E E

Direct vs. Indirect ELISA Advantages of Indirect ELISA: E Immunoreactivity of primary antibody is not affected by labeling Wide variety of secondary antibodies available on the market Signal amplification (several epitopes) Advantages of Direct ELISA: E Quick methodology – only one AB Cross-reactivity of second AB eliminated

Immobilized Antigen vs. Sandwich Mainly used for antibody detection E Sandwich ELISA: Mainly used for antigen detection

Inmunocito/histoquímica

Immunohistochemistry (IHC) combines histological, immunological and biochemical techniques for the identification of specific tissue components by means of a specific antigen/antibody reaction tagged with a visible label. IHC makes it possible to visualize the distribution and localization of specific cellular components within a cell or tissue.

What cellular antigens can we target? Cytoplasmic Nuclear Cell membrane Lipids Proteins

Examine cytoskeletal structure

Rol del biotecnólogo en el desarrollo de inmunoreactivos y vacunas

Stress Reactive chemical species Immuno-spin trapping Protein Cell Tissue Whole animal Stress Reactive chemical species Protein Detection of nitrone adducts Heterogeneous Immunoassays Mass spectrometry (MS) Molecular magnetic resonance imaging (mRMRI)

A B

Immuno-specific molecular probe

Array de proteínas

Bibliografía básica Immunoassays in Agricultural and Biotechnology. John Willey & Sons. 2011. http://www.amazon.com/Immunoassays-Agricultural-Biotechnology-Guomin-Shan/dp/047028952X/ref=sr_1_5?s=books&ie=UTF8&qid=1368731369&sr=1-5&keywords=immunoassay#reader_047028952X The Immunoassay Handbook, Fourth Edition: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques Tijssen, P. Practice and Theory of Immunoassays. Vol 15. In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevier. USA 1985. 549 Pags. ISBN 0-444-80634-2. Abbas, Abul K. Inmunología Celular Y Molecular. Elsevier España. 5ª edición. España 2004. 563 págs. ISBN 9781416023890