Importancia clínica de las RAVs con la terapia libre de IFN Patricia Baré IIHEMA, IMEX CONICET Academia Nacional de Medicina

Nuevas terapias contra HCV Blancos virales core, E1, E2, p7, NS2, NS3/4A, NS4B, NS5A y NS5B Blancos celulares ciclofilinas, microRNA 122, PIk4KIIIa (fosfatidil-inositol 4-kinasa III alfa) Combinar multiples drogas dirigidas a distintos blancos para lograr una inhibición sostenida de la replicación.

Características del HCV Producción: 1,000,000,000,000 viriones/día (100 veces más que HIV) Vida media estimada entre 2 y 5 horas Baja fidelidad de la RNA polimerasa: 1 error por cada 10.000 - 100.000 nucleótidos copiados (10 veces más que HIV) Virus RNA +. No existe DNA intermediario que se integre al genoma celular (la vida media del complejo de replicación de HCV está en el orden de las 10 a 20 horas) La evidencia sugiere que las variantes resistentes son preexistentes

Variabilidad del HCV y Resistencia La variabilidad genética del virus no está igualmente distribuida a lo largo del genoma y esto impacta en la posibilidad de adquirir variantes resistentes. region 5’-NCR (90%) > cápside (core) (81-88%) > gp de membrana (E1-E2) (50% HVR) Regiones que involucren funciones virales esenciales: traducción o replicación o con dominios estructurales principales (5’NCR y 3’NCR) serán los sitios más conservados entre las variantes. Kieffer T et al, J Antimicrob Chemother, 2010 Sustituciones en sitios conservados = correspondientes a funciones esenciales Variante resistente con disminución de la eficiencia de replicación (fitness viral)

Objetivos de las DAA Mejorar la tasa de respuesta viral sostenida: inhibir la replicación de variantes salvajes y RAVs de manera sostenida en el tiempo Minimizar los efectos adversos

Antivirales de acción directa contra HCV

Inhibidores de proteasa NS3/4A Clasificación de DAAs 3’UTR 5’UTR Core E1 E2 NS2 NS4B NS3 NS5A NS5B p7 Telaprevir Boceprevir Simeprevir Asunaprevir ABT-450 MK-5172 Faldaprevir Sovaprevir ACH-2684 Daclatasvir Ledipasvir Ombitasvir MK-8742 GS-5885 ACH-3102 PPI-668 GSK2336805 Samatasvir Sofosbuvir VX-135 IDX21437 ACH-3422 Dasabuvir BMS-791325 PPI-383 GS-9669 TMC647055 Deleobuvir Inhibidores de NS5B. Nuc Inhibidores de proteasa NS3/4A Ribavirina NS5B.NN Polimerasa Proteasa

Propiedades de las DAAs Potencia concentración efectiva para lograr el 50% de inhibición de la replicación viral en cultivo celular. Barrera genética a la Resistencia número de sustituciones de aminoácidos requeridas para conferir resistencia completa del virus a determinada droga. Eficacia hacia los distintos genotipos virales La variabilidad del sitio de acción de la droga impactará sobre la susceptibilidad de los distintos genotipos a la misma

IP I NS5B I NS5A - lineales macrocíclicos nucleósidos No nucleósidos Función de la proteína Clivaje de la poliproteína helicasa Síntesis de RNA Anclaje del complejo de replicación* Tipo de unión Sitio activo Inhibición de act.enz. x producto Arresta cadena Alostérico. Impide cambios conformacionales Sitio activo. Impide hiperfosforilación* Potencia Elevada Intermedia Muy elevada Especificidad Geno 1 Cualquier genotipo Específicos de genotipo. Geno 1 Barrera a R baja media alta RAVs frecuentes (in vivo/in vitro) R155 G/I/T T54 C V36A/M A156 S/T/V V170A/T Q80K D168V R155K S122 S282T M289L C316Y Y448H G554D D559G M28T Q30R/H/E L31V Y93H/N/C * Mecanismo incierto

Barrera genética a la resistencia Barrera baja a R: mutación primaria con bajo costo de la eficiencia en la replicación viral, puede emerger rápido. Barrera alta a la R: la mutación tiene un costo elevado para la eficiencia del virus y puede requerir de una mutación que compense este déficit. Halfon, Sarrazin, 2012

Falla virológica Concentración insuficiente de la droga Baja adherencia Resistencia viral es el resultado de un número limitado de sustituciones en el gen viral que codifica para la proteína blanco de una determinada droga.

Análisis de resistencia Análisis genotípico se analiza la región target de la droga y se comparan secuencias antes, durante y después de las terapias para detectar variantes nuevas. Análisis fenotípico Cultivos en sist. replicón y estudio de variantes emergentes al aplicar la droga. Las variantes R detectadas in vivo deben ser evaluadas fenotípicamente introduciendo los cambios en el genomas de HCV y determinando el cambio en la susceptibilidad a la droga (FC: fold change) en ensayos bioquímicos y cultivo celular, en comparación con la secuencia de referencia.

Factores involucrados Presión selectiva de la droga: potencia y concentración en el sitio de replicación Barrera genética a la resistencia: número de mutaciones requerido para pérdida completa de actividad de la droga Tasa relativa de replicación de las variantes resistentes sobre las variantes salvajes (fitness viral)

Características de las RAVs “PREEXISTENTES”. Se seleccionan bajo tratamiento Menor eficiencia de replicación que el virus salvaje Frecuencia basal Emergencia asociada a genotipos y subtipos virales según sitio involucrado (blanco de las DAAs)

Características de los RAVs Sensibilidad de las técnicas utilizadas Distintas mutaciones confieren distinto nivel de resistencia. Persistencia de corto plazo: no podrían persistir por tiempos prolongados Resistencia cruzada: Pueden conferir resistencia a drogas con el mismo mecanismo de acción secuenciación poblacional >25% secuenciación clonal >5% pirosecuenciación >0,5% Schneider, Sarrazin 2014; Sherman et al, 2011, Barnard et al, 2013, Bartels et al, 2013

Drogas aprobadas - información Variantes con susceptibilidad reducida a la droga y su nivel de reducción (FC; veces que reduce la EC50) RAVs halladas en pacientes sin SVR Presencia de RAVs basales y su impacto en la SVR Persistencia de RAVs post-tratamiento Resistencia cruzada http://www.fda.gov/Drugs/

Boceprevir Sin SVR: V36M, T54A/S, V55A, R155K, A156S y I/V170A T54 C R155 G/I/T A156 S/T/V Reducción > 15 veces la susceptibilidad a la droga. ~ 7% de prevalencia basal 53% de los pacientes mostraron 1 o más sustituciones asociadas a R y todas mostraron reducir la actividad de la droga en el cultivo celular

Telaprevir Sin SVR: V36M/A/L, T54A/S, R155K/T y A156S/T A156 V/T V36 M/A + R155 K/T T54 S/A + A156 S/T Reducción > 62 veces la susceptibilidad a la droga. V36, T54, R155, D168: 5% de prevalencia basal

Simeprevir D168V Más frecuentes R155K Se muestran las variantes resistentes más frecuentes en los individuos sin SVR. D168V R155K Q80 S122 Reducción > 50 veces la susceptibilidad a la droga. 14% de prevalencia basal Más frecuentes Búsqueda de variantes Q80K previo al uso de esta droga y recomienda aplicar terapia alternativa en caso de hallarse esta variante

Sofosbuvir RAVS RAVs en pacientes sin SVR S282T En resp parcial g1, g2b L320F En resp parcial g1 L159F En pacientes con HCC (g1a y 2b)y pac postrasplante C316N En postranspl, g1b V321A En geno 3 S282T M289L Reducción 2 a 18 veces la actividad de la droga. geno 3a. Sin reducción de la actividad de la droga. L159F V321A

2014 AASLD EASL Geno 1 Geno 2 Geno 3 Geno 4 Geno 5, 6 SOF o SIM + pegIFN/RBV SOF+SIM+RBV SOF+RBV SOF o SIM o DCV + pegIFN /RBV SOF + RBV SOF + SIM SOF + DCV Geno 2 SOF +RBV Geno 3 SOF + pegIFN RBV Geno 4 SOF o SIM o DCV +pegIFN,RBV Geno 5, 6

Ensayos clínicos - EASL 2014 DAAs N Pac target No SVR (n) RAVf TURQUOISE ABT-450/r (NS3) OMBITASVIR DASABUVIR (NS5B-NN) 380 tratados o naïve geno 1 NS3 NS5A 17 15 SAPHIRE I 631 naïve NS5B 8 SAPHIRE II 394 tratados 7 5

SINERGY (Osinusi et al) Ensayo DAAs N Pac target RAVb SVR-RAVs No SVR (n) RAVf ION 1 SOFOSBUVIR LEDIPASVIR ± RBV 865 naïve geno 1 NS5A NS5B 11, 16% no 96% 3 ION 2 440 tratados geno 1 NS3 14% 71% 89% 98% 11 ION 3 647 18% 90% 23 15 Everson G et al SOFOSBUVIR DACLATASVIR (GS5816) 154 geno 1- 6 32% 97% 7 4 PEARL I SOFOSBUVIR DACLATASVIR 135 tratados o naïve geno 4 - PEARL III SOFOSBUVIR LEDIPASVIR 419   geno1b NS5ANS5B 1 SINERGY (Osinusi et al) 14 tratados con SOF EASL - 2014

Ensayo DAAs N Pac target RAVb SVR-RAVs sin SVR (n) RAVf EASL - 2014 Ensayo DAAs N Pac target RAVb SVR-RAVs sin SVR (n) RAVf cWORTHY MK-8742(NS5A) ±RBV MK-5172 (NS3) 253 naïve o tratados geno 1 NS5A NS3 13% 2% 82% 100% 9 59 naïve HIV+ geno 1 - 3 HALLMARK DUAL DACLASTAVIR ASUNAPREVIR 645 Tratados o naïve geno 1b 12% 39% 79 61 Sulkowski M et al SOFOSBUVIR ±RBV 211 naïve g1,2,3 Tratados geno 1 NS5B 15% 9% 97% 1 (g3) Everson G et al SOFOSBUVIR DACLATASVIR 154 geno 1- 6 32% 7 4 NEJM-2014, EASL - 2014

Ensayo DAAs N Pac target RAVb SVR-RAVs sin SVR (n) RAVf EASL - 2014 Ensayo DAAs N Pac target RAVb SVR-RAVs sin SVR (n) RAVf COSMOS SIMEPREVIR SOFOSBUVIR ±RBV 80 NR geno1 F0-2 NS3 34% 89% 3 87 naïve y NR F3-4 32% 96% 1 Lalezari et al FALDAPREVIR PPI-668 DELEOBUVIR*±RBV 36 geno 1a NS5A NS5B 36% 22% 28% 82% 5 Gane et al DACLATASVIR VX-135 (NS5B-N) 23 naïve geno 1 1* * *estudios incompletos **discontinuado

Observaciones IP I NS5B-NN I NS5A RAVs más frecuentes ante falla virológica Q80K D168V/Y/A R155K V36A/M Y56H A156T/A/G/V S556G C316N D559N Y561H Q30R/Q/H M28T/V/G L31V/M Y93L/H/N H58P/H La presencia de RAVs basales no fue predictiva de la falla virológica. Sin embargo, en la mayoría de los pacientes con falla virológica se detecta al menos 1 RAV. No se detectaron variantes preexistentes S282T con R al SOF. Ledipasvir fue efectivo contra RAVs en pacientes pretratados con SOF

Utilidad clínica de RAVs basales En pacientes sin tratamientos previos Valor epidemiológico: evaluar existencia de cepas resistentes que se transmiten (epidemiología local) En pacientes con terapia antiviral previa para predecir su sensibilidad a otros antivirales. para prevenir resistencia cruzada

RAVs con impacto clínico Prevalencia basal Detección Particularidades Q80K. 1a Q80K. 1b 48% Norteamérica 19% Europa 9% Sudamérica 0,5% Basal Falla virológica Reduce susceptibilidad a SMV. Persiste en ausencia de la droga. Impactaría en la emergencia de mutantes adicionales L31M/F 1b 4 – 23% 58% de los casos sin resp.viral sostenida S282T <0.1% Reduce susceptibilidad a SOF Baja eficiencia de replicación. Ledispavir: efectivo contra estas variantes en pacientes pretratados con SOF. A30K 8% g1 28% g2 61% g3 pérdida de susceptibilidad a DCV (Berger et al, 2014; Fevery et al, EASL2014; Svarovkaia et al, 2013; Karino et al, 2013)

Al día de hoy… La presencia de RAVs basales no es predictiva de la falla virológica. El verdadero impacto de RAVs preexistentes NO ha sido determinado sustituciones preexistentes en NS3 (retratamiento) o NS5A (DCV) La consecuencia de las RAVs que se encuentran en BAJA PROPORCIÓN se desconoce

MUCHAS GRACIAS