Práctica Enzimas de Restricción

Enzimas de restricción  Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias  Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio  ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio

Enzimas de restricción  Se han identificado cientos  La mayoría reconocen y cortan secuencias palindrómicas  Muchas dejan “puntas pegajosas”  Se pueden hacer cortes muy precisos del ADN al escoger la enzima  Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria

Palíndrome oso radar reconocer rotor salas seres somos sometemos oro ala ojo

Secuencia palindrómica en biología 5'- G A A T T C -3' 3'- C T T A A G -5' Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras

Algunas enzimas usadas comúnmente Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTT Sac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G

Uso de enzimas de restricción La actividad depende de condiciones precisas: pH Temperatura Concentración de sales Iones Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas: 3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul

Tipos corte

Utilidad para ADN recombinante

Marcador de peso molecular Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas O la escalera de 1kb

Plásmidos en gel

Electroforesis de plásmidos Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado. Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza

Digestión plásmidos Número bandas= número de sitios de restricción pGEM-TpGEM-T/EcoRI pUWL201 pUWL201/EcoRI

Digestión ADN genómico

Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis

Deleción en FQ Fibrosis quística Recesiva Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos Degradada en RE, no llega a membrana celular

Diagnóstico por sitios de restricción

Mutación: Cys282Tyr Mutación Hemocromatosis

Mutación: His63Asp Mutación Hemocromatosis

online.org/prot/Research_Tools/Online_To ols/Restriction_Digestion/index.html

Lambda cortado con EcoRI 5 cortes

Lambda cortado con Eco RI 6 fragmentos

Práctica Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción