LA PERTURBACIÓN DE LA HOMEOSTASIS DE S-NITROSOTIOLES Y EL ESTRÉS NITROSATIVO MODULAN LA PROLIFERACIÓN CELULAR EN CÁNCER DE MAMA Unidad de Investigación y Servicio de Oncología Médica, Hospital Universitario Reina Sofía, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba ( IMIBIC) Avda. Menéndez Pidal s/n, Córdoba España. A.Cañas, L.M. López-Sánchez, I. Porras, V. Hernández, G. Pulido, M.T. Cano, J.R. De La Haba-Rodríguez, C. Lopez-Pedrera, E. Aranda, A. Rodríguez-Ariza A. Cañas: A. Rodríguez-Ariza: MCF-7MDA-MB-231 pERK 1/2 ERK 1/2 pAKT (Ser) AKT Ciclina D1  -Actina CSNO 100 nM Aur 2 µM Introducción/Objetivos: Generalmente, en tumores se detectan niveles elevados de óxido nítrico (NO) comparado con el tejido sano circundante, y las modificaciones de proteínas inducidas por el NO pueden constituir un factor regulador significativo tanto en la progresión del tumor como en el tratamiento antitumoral. La formación de S-nitrosotioles (SNO) es una modificación de la cisteína, también conocida como S-nitrosación ó S-nitrosilación, y controla la función de las proteínas de una forma similar a la fosforilación. Uno de los mecanismos específicos que modulan la de-nitrosilación de proteínas es el sistema tioredoxina/tioredoxina reductasa (Trx/TrxR). La manipulación o alteración de este sistema enzimático puede alterar la homeostasis de SNO en células tumorales, proporcionando nuevos conocimientos sobre el papel del NO en cáncer. Metodología: Células humanas de cáncer de mama (MCF-7, MDA- MB-231 and BT-474) se pretrataron o no con auranofina (2 μM), un inhibidor específico de la TrxR, y se expusieron a diferentes dosis (100 nM o 500 uM) de S-nitroso-L- cisteína (CSNO). La proliferación celular se midió usando el ensayo XTT, y la fosforilación de Akt y Erk 1/2 y los niveles de ciclina D1 se determinaron por western blot usando los anticuerpos específicos. Resultados: El tratamiento con auranofina, en presencia o ausencia de CSNO 100 nM, incrementó significativamente la proliferación en células MCF7. Sin embargo, el efecto proliferativo de la auranofina no se observó en células MDA-MB-231 y BT-474 (Fig 1). Como se observa en la Figura 2, el tratamiento de células MCF-7 con auranofina, incrementó la fosforilación de las quinasas de señalización ERK 1/2 y AKT, y los niveles de expresión de la proteína promotora de la progresión del ciclo celular, la ciclina D1. Significativamente, el tratamiento de células MCF7 con CSNO 100 nM, incrementó la fosforilación de ERK 1/2 y los niveles de expresión de la ciclina D1, y potenció los efectos de la auranofina (Fig.2). Las células MCF-7 y BT- 474 expresan el receptor de estrógenos alfa (ER-α), mientras que las células MDA-MB-231 y BT-474 tienen proteínas p53 mutadas. Por lo tanto, posteriormente analizamos la participación de ER-α y/o p53 en la respuesta de las células MCF7 a la auranofina. Como se observa en la Figura 3, el efecto pro-proliferativo de la auranofina en células MCF-7 se eliminó mediante el pretratamiento con fulvestrant, un antagonista del ER-α (Fig 3A). Por otra parte, pifithrin-α un inhibidor de p53, también fue capaz de inhibir el efecto de la auranofina en células MCF7 (Fig. 3B). Significativamente, en las tres líneas celulares, una dosis elevada de CSNO (500 µM), redujo la proliferación celular y este efecto fue potenciado con el pretratamiento con auranofina (Fig.4). Conclusiones: La perturbación de la homeostasis de SNO modula el crecimiento tumoral en función del grado del estrés nitrosativo causado. Un moderado estrés nitrosativo causado por la inhibición TrxR promueve el crecimiento de células de cáncer de mama en un contexto ER positivo y p53 no mutado. Esto es importante, ya que el 70-80% de tumores mamarios son ER positivos y poseen un p53 funcional. Por el contrario, un severo estrés nitrosativo causado por la exposición a altas dosis de CSNO, inhibió el crecimiento de células de cáncer de mama, independientemente del contexto ER/p53. Este efecto fue además potenciado por la inhibición de TrxR por auranofina. Financiado por la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía, PI-0230/09. Control Aur +CSNO CSNO 100 nM Aur 2 µM Figura 1.- La auranofina incrementa la proliferación de células MCF-7. Las células fueron expuestas a los tratamientos indicados y la proliferación se determinó después de 48 o 72 h (*p  0,05, comparado con el control) CSNO 500 µM Control Aur +CSNO Aur 2 µM MDA-MB-231 MCF-7 BT h 72h Prliferación celular (%) * * * * Figura 3.- El efecto pro- proliferativo de la auranofina en células MCF7 es eliminado por el fulvestrant (FV), un antagonista del receptor de estrógenos ER-α, o el inhibidor del p53,el pifithrin-α (PFT-α). Las células MCF7 se preincubaron con fulvestrant (FV) 100 nM o pifitrina-α (PFTα), y se expusieron a los tratamientos indicados y la proliferación celular se determinó después de 48 o 72 h (*p  0,05, comparado con el control). Figura 2.- Auranofina y/o CSNO aumentaron la señalización de ERK 1/2 y la expresión de ciclina D1 en células MCF7. Las células fueron expuestas durante 6 horas a los tratamientos indicados y la fosforilación de ERK 1/2 y los niveles de ciclina D1 fueron determinados por western blot usando los anticuerpos específicos. BT-474MDA-MB-231MCF-7 48 h72h48 h72h48 h72h * * * Figura 4.- Un severo estrés nitrosativo redujo la proliferación celular en células de cáncer de mama. Las células se expusieron a los tratamientos indicados y la proliferación celular se determinó después de 48 o 72 h (*p  0,05, comparado con el control, # p  0,05, comparado con CSNO). * Prliferación celular (%) # # * * * * * * # * * -FV+FV -PFTα +PFTα Prliferación celular (%) * * * * B A CSNO 100 nM Control Aur +CSNO Aur 2 µM BT