SONDAS DE ANTICUERPOS PARA PROTEÍNAS Detección de proteínas específicas mediante anticuerpos

INMUNOTRANSFERENCIA: Western Blot Técnica que se utiliza para identificar y localizar proteínas con base en su capacidad para unirse a anticuerpos específicos. El término “blotting” hace referencia a la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma.

Pasos

TÉCNICA SEPARAR LAS PROTEÍNAS Las proteínas se someten a desnaturalización tratándolas con un detergente iónico (sulfato de dodecilo sódico o SDS) a 100°C Luego, se realiza electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) El detergente cubre de manera uniforme a todas las proteínas, negativizando la carga de la superficie de la proteína

Las proteínas migran dentro del campo eléctrico con base en la cantidad de moléculas de SDS unidas a ellas, cantidad que depende a su vez del tamaño de la proteína Obtendremos un patrón de bandas que dependerá del número de proteínas presentes en la muestra y de su tamaño. Por lo tanto este método separa proteínas conforme a su peso molecular.

COLOCAR UNA MEMBRANA DE NITROCELULOSA EN EL GEL Las proteínas se transfieren de modo electroforético a una pieza de papel filtro (nylon o nitrocelulosa) al cual se adherirán a través de interacciones no polares. Luego de poner en íntimo contacto el gel con una membrana de nitrocelulosa o PVC, los colocaremos en un aparato para que se produzca una electrotransferencia de las bandas de proteína del gel a la membrana. En ese proceso se logra una transferencia cuantitativa, manteniendo además el mismo patrón del gel.

DIFERENCIACIÓN DE PROTEÍNAS Se revelan por el agregado de un anticuerpo específico. De esta forma se visualizarán las bandas de proteínas y se podrá calcular la concentración de cada una en la muestra original. El uso de anticuerpos le otorga a la reacción una especificidad que de otro modo no tiene.

INCUBAR LA ENZIMA En una mezcla de la reacción que sea específica para la enzima. PONER LA PELÍCULA DE RADIOGRAFÍA EN GEL Para detectar un flash de la luz, que es emitida por la enzima

Sustrato Producto detectable Enzima Método directo de detección: el anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.

Sustrato Producto detectable Enzima Método indirecto de detección: el anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.

Transferencia de las proteínas a la membrana

Proceso simplificado del Western Blot

25 27 Western Blot de varios sueros de pacientes. La primera tira muestra un control positivo, se observa además de las proteínas del virus una gp 160 que no forma parte del virus pero sí de las proteínas que aparecen durante el ciclo infectivo. La tira con el número 27 es un control negativo. El resto de las muestras tienen bandas virales.

FUNDAMENTO La técnica del Western Blot (también llamado “inmunoblotting” debido a que se utilizan anticuerpos para detectar el antígeno o los antígenos específicos de interés) es una técnica que nos permite detectar la presencia de una proteína en un homogeneizado o extracto de tejido.

En esta técnica, se analizan las proteínas que reaccionan con anticuerpo en la mezcla separando primero las proteínas de dicha mezcla mediante una electroforesis en gel desnaturalizante. La especificidad de la unión antígeno – anticuerpo permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas.

APLICACIONES EN LA MEDICINA DIAGNÓSTICA DE LAS ENFERMEDADES VIRALES (SIDA) El Western Blot es una de las técnicas de mayor uso en el diagnóstico de infección por el virus HIV aunque no se trata de una aplicación única, se la usa en diagnóstico clínico y en investigación. Este ensayo también permite determinar el peso molecular de una proteína y medir la concentración relativa de una proteína en una muestra.

EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA INFECCIÓN POR TRIPANOSOMA CRUZI El Western Blot es una técnica que se utiliza para la detección de anticuerpos contra antígenos de T. cruzi. ESPECIFICA LOS ANTICUERPOS RELACIONADOS CON LA ENFERMEDAD DE LYME EN EL DIAGNOSTICO DE LA CISTICERCOSIS PARA EL DIAGNÓSTICO DE BRUCELOSIS HUMANA EN LA IDENTIFICACIÓN DE INMUNÓGENOS DE FASCIOLA HEPATICA

INMUNOPRECIPITACION: ELISA Se da cuando la reacción Antígeno - Anticuerpo a determinadas condiciones, el complejo formado se inestabiliza y precipita, de tal forma que el precipitado formado es fácilmente detectable y cuantificable. La técnica de ELISA es una técnica de inmunoprecipitación pero a la vez es una técnica inmunoenzimática ya que se basa en el uso de antígenos y anticuerpos marcados con una enzima que al añadírsele un sustrato se observará un color fácilmente detectable y cuantificable.

TÉCNICA

La técnica ELISA (“Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay” Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) consiste en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. El procedimiento más común se realiza en una placa de 96 pocillos sobre la que se fijan los anticuerpos de interés. Al añadir la muestra que contiene el antígeno complementario se produce una unión que se puede detectar mediante la adición de un segundo anticuerpo contra el mismo antígeno, éste marcado con una enzima que al añadirle un sustrato se hidroliza dando una reacción de color. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra analizada.

Pasos generales de un ELISA 1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo. 2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos. 3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido 5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adición del sustrato 9. Unión del sustrato a la enzima 10. Desarrollo del color

Pocillos utilizados en la prueba de ELISA

FUNDAMENTO El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoabsorbente) la reacción antígeno- anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

TIPOS DE ENSAYOS ELISA ELISA DIRECTO (ENSAYO ELISA SIMPLE DE DOS CAPAS) Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).

ELISA INDIRECTO Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA SÁNDWICH (ENSAYO DE CAPTURA DE ANTÍGENO Y DETECCIÓN MEDIANTE INMUNOCOMPLEJOS) Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

APLICACIONES IDENTIFICACIÓN (SCREENING) DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Hepatitis C: Prevalencia de anticuerpos VHC Vibro cholerae: Prevalencia del antígeno Iga Anti- Lipopolisacáridos VIH: Prevalencia del antígeno p24 del VIH-1 Herpes: Presencia del anticuerpo anti IgG Mycobacterium tuberculosis: Presencia del anticuerpo anti IgG Sífilis: Presencia del anticuerpo anti IgG

Papilloma Virus: Presencia de anticuerpos anti-VPH Toxoplasmosis: Presencia del anticuerpo anti IgG y anti IgM Salmonella: Presencia de antígenos O y los antígenos H Shigella: Presencia del anticuerpo anti IgG Malaria: Presencia del anticuerpo anti IgG Peste porcina clásica: Presencia del anticuerpo anti IgG Cuantificación de hormonas: gonadotropina, progesterona, testosterona, hormonas tiroideas, etc. Cuantificación de inmunoglobulinas: IgG, IgE, IgA