Pruebas bioquímicas de identificación Bioq. María de los Ángeles Sosa

Pruebas de Identificación rápidas Prueba de la catalasa Prueba de la coagulasa Prueba de PYR Prueba de oxidasa

Pruebas de Identificación para Cocos Gram + DNasa Prueba del manitol salado Bilis esculina CAMP Hidrólisis del hipurato Voges –Proskauer Pruebas de sensibilidad a ATB Disco de Optoquina Disco de novobiocina Disco de Bacitracina

catalasa

Prueba de la catalasa Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa. Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una colonia unas gotas de H202 3 %. H202 H20 + 02 Liberación de burbujas rápida y sostenida indica la producción de oxígeno molecular = prueba (+) Consideraciones: No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).

coagulasa

Prueba de la coagulasa Fundamento: Detecta un factor de agregación “clumping factor” en la superficie de la bacteriana. Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a una especie de Staphylococcus y se emulsifica en una gota de plasma de conejo. Interpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto = prueba (+). Si el resultado es negativo ensayar la producción de coagulasa en tubo. Consideraciones: Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+). Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC.

Prueba de PYR

Prueba del PYR: Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para la identificación rápida de enterococos. Procedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir un disco de PYR. Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C. Tiempo de lectura: 5 minutos. Interpretación: Disco rosado o rojo (+) Disco y/o solución amarillo a incoloro (-). Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.

DNAsa

Prueba de la DNAsa Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo . Procedimiento: Se inocula el microorganismo en manchas densas sobre agar DNA y después de 18 a 24 hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita el DNA nativo del medio. Interpretación: colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado = prueba (+)

Manitol salado

Agar Manitol salado Fundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y peptonas. Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC. Interpretación: Crecimiento y viraje S. aureus Crecimiento sin viraje. S. epidermidis Consideraciones: La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para aislamiento).

Bilis Esculina

Prueba de la bilis-esculina: Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias (estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia de 1-4% de sales biliares. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie de un pico de flauta. Incubar 24 hs. Interpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación hasta que la hidrólisis sea aparente. Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos

Prueba de CAMP Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-hemolítica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis. Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría de la cepa de S. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en estudio. Tiempo y Tº de incubación: Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis (en CO2 aumentan los falsos positivos). Interpretación: El sinergismo se observa como un área de ß- Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona de desarrollo más cercana a ambas estrías. 16

Prueba de CAMP

Prueba del hipurato de sodio Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina. Procedimiento: Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%. Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina. Interpretación: La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos = prueba (+) Benzoato de sodio La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.

Hidrólisis de hipurato

Prueba de la susceptibilidad a la Novobiocina Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la novobiocina. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en agar Mueller Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de Novobiocina (5 µg). Interpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro mayor o igual a 16 mm Staphylococcus R Micrococcus S Consideraciones: Kirby Bauer (Difusión en disco) Inoculo sin incubación previa Tiempo de lectura: 24 hs. Tº de incubación: 33º a 35º

Prueba de la Bacitracina: Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la bacitracina. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS según técnica de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U). Interpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición del desarrollo. Consideraciones: Kirby Bauer (Difusión en disco) Inoculo sin incubación previa Tiempo de lectura: 18 a 24 hs. Tº de incubación: 33º a 35º en CO2 Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a 50% de falsos negativos.

Prueba de la Bacitracina

Prueba de la optoquina

Pruebas de Identificación para enterobacterias Prueba OF Prueba de la oxidasa o citocromooxidasa TSI SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad) Rojo de metilo - Voges –Proskauer ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido) Citrato Ureasa Fenil-alanina-desaminasa Descarboxilasas

Oxidasa NEG POS

CITOCROMOOXIDASA O PRUEBA DE LA OXIDASA Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos. Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para-difenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta = prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo. Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar)

Prueba OF

PRUEBA DE OXIDACIÓN FERMENTACIÓN (O-F) Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los microorganismos no fermentadores. Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estéril. Interpretación: Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo. Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo. Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su color original.

Triple Azúcar Hierro

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR) Fundamento: Sirve para detectar la fermentación de hidratos de carbono. El medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas; también tiene un indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar la formación de SH2. Procedimiento: El medio se fracciona en picos de flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por punción y estría. El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR) Interpretación: Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido) Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el fondo ácido. Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido) Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo. 3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces intensificación del color.

Consideraciones del TSI Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el caso 1 se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas y se alcaliniza el medio. Con respecto al sulfhídrico pueden presentarse distintas modalidades: Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas, esto se puede dar en Salmonella, se lee: alc/ac (SH2) (gas) También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee: ac/ac (SH2). Además se puede visualizar en el tubo la producción de gas por parte del microorganismo, entonces en el medio se observan burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo aparece levantado.

SIM

SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – MOVILIDAD) Fundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene: Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivo Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la punción. Procedimiento: se inocula el microorganismo por punción con ansa de punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por las paredes del tubo. Interpretación: Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-dimetilaminobenzaldehido. M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estría M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no ennegreciendo de todo el medio).

SIM SH2+ Ind+ Mot+ SH2+ Ind- Mot- SH2- Ind+ Mot+ SH2- Ind- Mot-

Prueba de VP y RM

ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER: Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo. Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs.. Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP. Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4. VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).

ONPG

ONPG (O-NITROFENIL-β-GALACTOPIRANÓSIDO) Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de la lactosa La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la célula bacteriana. Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+). Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-) Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de β-galactosidasa= prueba (+). Consideraciones Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.

Citrato

CITRATO Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol. Procedimiento: El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC. Interpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato.

Ureasa Positivo Negativo

UREA: Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima ureasa. Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C. Interpretación: Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia.

Fenilalanina (-) (+)

FENIL-ALANINA-DESAMINASA: Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima FENIL-ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo. Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela con cloruro férrico. Interpretación: El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.

Lisina Decarboxilasa

AMINOÁCIDOS: DESCARBOXILASAS: Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formando aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido. Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina en la identificación de enterobacterias. El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es lila. Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no. Interpretación: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no es descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la formación de ácidos

Lisina Hierro Agar (LIA) LIA – SH2 - LIA + SH2 - LIA + SH2 -

LIA: Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación de enterobacterias. ► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio decultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa. ► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.