CITOGENÉTICA EN EL MIELOMA MÚLTIPLE Esperanza Such Lab. Citogenética

Introducción El mieloma múltiple es una neoplasia caracterizada: por la acumulación incontrolada de células plasmáticas clonales en MO, y por una gran heterogeneidad en cuanto a las alteraciones genéticas que presentan. Cabe pensar que bajo este termino se engloben enfermedades diferentes. Se van a revisar los conocimientos más destacados que han dado lugar a las técnicas de análisis genéticos y a su papel en el diagnostico.

Introducción Diversos estudios moleculares indican que la célula clonogénica es una célula B madura que ha pasado por el centro germinal del folículo linfoide. Estas células han sufrido un proceso de hipermutación somática o un cambio del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. El linfocito migra a la médula ósea donde puede permanecer durante largo tiempo como célula plasmática.

Introducción Un % importante de pacientes con MM tienen una fase preclínica de MGUS en la que la clona maligna permanece estable durante años hasta que, por causas desconocidas, escapa a los mecanismos reguladores que limitaban su crecimiento, y se produce la transformación maligna. Los datos actuales sugieres que el MM aparece como consecuencia de diferentes pasos oncogénicos. Hallek et al, 1998

Introducción Posiblemente el evento inicial consiste en translocaciones del gen de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (IgH) situado en 14q32 debidas a: Errores durante el proceso de recombinación de IgH Errores durante la fase de hipermutación somática en el centro germinal del folículo linfoide. Bergsagel el al, 2004

Introducción

Ciclo celular Se ha revisado recientemente por la posibilidad de que haya dos vías en la patogénesis del MM: Hiperdiploide. Hipodiploide o diploide. Entre el 55-60% de los mielomas presentan anomalías clonales en el contenido de DNA (aneuploidías) generalmente hiperploidías. El ciclo celular Se mide por citometría de flujo. Permite distinguir anomalías en el contenido de DNA en poblaciones celulares.

Ciclo celular HIPERDIPLOIDES: Se generan clones menos agresivos que implican un mejor pronóstico Están presentes desde las primeras fases de la enfermedad Se observa en las MGUS donde el porcentaje de aneuploidías es del 73%. Se pueden usar para estudios de EMR con una sensibilidad de 10-4

Ciclo celular Valor pronóstico: Permite determinar el porcentaje de células plasmáticas en las diferentes fases del ciclo celular. El % de células plasmáticas en fase S (DNA mayor a 2n y menor a 4n) es un parámetro directamente relacionado con la actividad proliferativa del clon tumoral.

Ciclo celular Los pacientes con un mayor porcentaje de células plasmáticas en fase S (3%) tienen una supervivencia más corta.

Ciclo celular Mateo et al, 2005

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL El análisis cromosómico mediante citogenética convencional, que ha generado información de primer orden en otras hemopatías malignas, se ha visto limitado en el caso del MM. Bajo índice proliferativo de las células mielomatosas Infiltración desigual y, generalmente, escasa de la MO. Reducido número de metafases analizables que, en buena parte, proceden de las células mieloides de la MO.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Los pocos cariotipos que se encuentran suelen ser complejos y con múltiples alteraciones numéricas y estructurales. El porcentaje de los cariotipos descritos suele ser muy variable, raramente supera el 30% en las distintas publicaciones. Impide detectar anomalías estructurales más importantes.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Sin embargo proporciona una visión global del genoma y es una buena herramienta para determinar la ploidía del MM.

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Cambios numéricos Ganancias: 3,5,7,9,11,15,18,19,21 Perdidas: 8,13,14,16,22,X,Y Cambios estructurales 1q Trisomias parciales 1p Delecciones 14q t(11;14)(q24;q32) 8q t(8;14)(q24;q32) t(8;22)(q24;q11) t(2;8)(p12;q32) 11q t(11;14)(q13;q32) Ganancias 6q Deleciones 16p ó 16q t(1;16)(q11;q11) 22q11 19q y 19p Traslocaciones

FISH La introducción de la fluorescencia en los últimos 20 años ha supuesto un avance extraordinario en el campo de la citogenética. En el MM la técnica citogenética más usada es la hibridación in situ fluorescente (FISH).

FISH Resuelve la mayoría de los problemas inherentes a la citogenética convencional No necesita metafases Elevada resolución permite detectar translocaciones crípticas. Su objetivo son las alteraciones específicas. Debido a la baja infiltración, se debe realizar siempre sobre células mielomatosas purificadas

FISH Inicialmente se creía que sólo el 30% de los MM presentaban alteraciones citogenéticas. Ahora, gracias a la FISH se sabe que el porcentaje es aproximadamente del 60%. Las anomalías más frecuentes son las translocaciones del 14q32 (40% de los pacientes) que provoca la yuxtaposición del gen de la cadena pesada de las Ig frente a diversos genes.

IGH En el MM la translocación (Tx) de IGH se clasifican: Primarias (40%): Consideradas un proceso inicial en la patogénesis. Son consecuencia de errores en los procesos de remodelación del DNA específico de las células B. Los puntos de rotura ocurren en las regiones adyacentes a las regiones de cambio de IGH

IGH Secundarias (20%): implicadas en la progresión Podrían estar mediadas por otros tipos de mecanismos de recombinación no dirigidos a las regiones recombinantes de IgH. El resto de los pacientes (40%) no presentan alteraciones de IgH.

IGH A diferencia de otros síndromes linfoproliferativos B, en MM hay una marcada diversidad de loci cromosómicos implicados en Tx de IGH (60%). En un 40% está implicados los siguientes genes:

IGH Las más frecuentes son: GEN IMPLICADO TRANSLOCACIÓN FRECUENCIA CCND1 t(11;14)(q13;q32) 20% FGFR/MMSET t(4;14)(p16;q32) 15% CMAF t(14;16)(q32;q23) 5-10% CCND3 t(6;14)(p21;q32) 3% MAFB t(14;20)(q32;q11) bastante rara

Δ13 Tiene una frecuencia del 40-50% Se trata de la perdida de material genético más frecuente en el MM. Presenta una fuerte asociación con otras anomalias genéticas: 80% de los MM con t(4;14) o t(14;16) 65% de los casos con add(1q) 70% de las deleciones p53 65% de los hipodiploides La variabilidad de clonas existente con Δ13 iría a favor de que es un evento secundario

Δ13

Δ13 Clásicamente la monosomía se ha asociado a con un pronóstico adverso independiente de la técnica utilizada (cariotipo o FISH) Según algunos autores (grupo de Arkansas) la influencia negativa de la monosomía no es tan marcada cuando se detecta únicamente por FISH. Estudios más recientes no encuentran una disminución en la supervivencia de los pacientes que sólo tienen monosomía 13.

p53 Está localizado en el cromosoma 17p13, está implicado en el control de la proliferación, diferenciación y apoptosis celular. La progresión tumoral depende de la inactivación de este gen o de pérdidas alélicas. Tiene una incidencia menor que Δ13 (5-10%) pero se perfila como una alteración de pronostico desfavorable.

CCND1 t(11;14) Incidencia del 15-20%. Implica al gen CCND1 provocando una sobreexpresión de la proteína ciclina D1. Esta ciclina tiene un papel clave en la regulación del ciclo celular particularmente en la progresión de las células de la fase G1 a S. Se había asociado a un curso agresivo de la enfermedad pero en la actualidad se ha demostrado que la supervivencia es similar o mayor que los que no la tienen. La amplificación del gen de la ciclina D1 puede estar producida por otros mecanismos que aumentan su incidencia al 30%.

FGFR/MMSET t(4;14) Incidencia del 15% Es indetectable por citogenética convencional. Como consecuencia de la translocación se desregulan dos genes prooncogénicos situados en der(4): FGFR3 (fibroblast growth-factor receptor 3) MMSET (multiple myeloma SET domail) Se asocia con IgA y del(13), con elevada actividad proliferativa y niveles aumentados de B2-microglob, asociados con mal pronostico y con supervivencias cortas. Se considera uno de los factores pronósticos independientes con mayor peso

CMAF t(14;16) Incidencia del 5-10% Aumenta la expresión de C-MAF que es un factor de transcripción involucrado en procesos celulares básicos incluidos proliferación, diferenciación y respuesta IL6. Recientemente se ha descrito otro gen, WWOX, que también se encuentra en la región 16q23. Los pacientes con esta alteración presentan características muy similares a los que tienen la t(4;14) y una supervivencia corta. Fonseca et al, 2003

Add(1q) Son ganancias del brazo largo del cromosoma 1. Es una de las alteraciones mas recurrentes en el MM. No se había estudiado el impacto en la supervivencia hasta que el grupo de Arkansas demostró: el aumento de la expresión del gen CKS1B localizado en 1q21 imparte mayor agresividad al curso clínico de la enfermedad y una reducción significativa de la supervivencia.

FISH El resto de alteraciones son poco frecuentes (5%) pero la presencia de un cariotipo aberrante o hipodiploide se asocia a mal pronostico. Las alteraciones citogenéticas son muy frecuentes en el MM y claves en el pronóstico, por lo que se considera un estudio obligado en todo paciente con MM.

Los pacientes con translocaciones de IGH, RB o deleciones de p53 tienen menor supervivencia y tiempo de progresión en pacientes con ATSP. NC Gutierrez et al, 2007

La deleción de RB no tiene valor pronóstico negativo si no va asociado a otras alteraciones NC Gutierrez et al, 2007

Los reordenamientos de t(4;14) son de mal pronostico independientemente de las alteraciones adiccionales presentes. NC Gutierrez et al, 2007

La t(11;14) y deleciones de RB no tienen valor pronóstico. p53 tiene valor pronóstico desfavorable. NC Gutierrez et al, 2007

El 79% de los pacientes con t(4;14) presentan del RB. El 62% de los pacientes con reordenamientos de IGH presentan del de RB. El 79% de los pacientes con t(4;14) presentan del RB. NC Gutierrez et al, 2007

Conclusión TRANSLOCACIÓN FRECUENCIA PRONÓSTICO Δ13 40-50% Citogenética convencional Estudio del Ciclo Celular FISH TRANSLOCACIÓN FRECUENCIA PRONÓSTICO Δ13 40-50% NO INFORMATIVO p53 5-10% DESFAVORABLE IGH t(14; x): 60% - t(11;14)(q13;q32)bcl1 20% FAVORABLE t(4;14)(p16;q32)fgfr3 15% t(14;16)(q32;q23)maf Add(1p)

Línea vertical de Neoplasias Hematologicas Red de Mieloma y Linfoma

PLAN ESTRATÉGICO Y GRUPOS PARTICIPANTES La clave del éxito de esta red ha radicado en su doble planteamiento: La existencia de un grupo clínico-terapéutico nacional (GEM/PETHEMA) que engloba a más de 100 hospitales con dos laboratorios que centralizan nuevas técnicas de diagnóstico biológico y una serie de laboratorios de investigación básica alrededor. Un modelo de investigación traslacional basado en la continua interacción entre laboratorios básicos y grupos clínicos (ej: los estudios sobre mecanismos de acción de nuevos fármacos llevan a ensayos fase I/II) El plan estratégico actual es mantener y desarrollar este modelo. En función de la nueva estructura de la Red de Cáncer se establecen: a) Tres plataformas horizontales Programas 2 y 4: Diagnóstico Molecular, Citogenético e Inmunofenotípico: Centralizado en tres laboratorios para todos los hospitales de grupo GEM y coordinados desde las plataformas horizontales correspondientes. Laboratorio del Hospital 12 de Octubre (Dr. JJ. Lahuerta) Laboratorio del Hospital Clínico de Salamanca (Dr. San Miguel) Laboratorio del Hospital la Fe de Valencia (Dr M.A. Sanz) * Actuará como apoyo el laboratorio del CIMA (Pamplona): (Drs. Odero/Calasanz)

Citogenética Separación de células CD138+ mediante esferas magnéticas. Obtenemos una pureza del 70-90%. Este método no distingue entre células normales y plasmáticas tumorales.

PANEL DE FISH