CITOGENÉTICA Ana Esteban Díez Curso 2011/2012

La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de bandeado G en cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética molecular de hibridación por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación por genómica comparativa (CGH).

TÉCNICA Esta técnica es para sangre periférica. La muestra debe ser 5ml de sangre venosa recogida en tubo con anticoagulantes de heparina de litio. Se coge la capa de leucocitos. TÉCNICA

Identificación de la muestra  Se debe identificar el tubo y la historia clínica dándole un número de registro. Observación de la muestra El paciente no debe haber sido transfundido en los últimos 2 meses. La extracción debe hacerse en ayunas (preferiblemente). Anotar en el mismo cuaderno, el día de la siembra y si el cultivo va a ser de 48 o 72 horas.

Preparación de la muestra Centrifugar la muestra durante 5 min a 1000 r.p.m. Si la muestra está turbia ó muy ictericia hay que realizar un lavado con suero fisiológico, volviendo a centrifugar y decantando el sobrenadante del lavado. Preferiblemente hay que pasar a la fase de siembra en las primeras 24 horas, si no es posible debe mantenerse la muestra a 4º C en la nevera.

Preparación del medio de cultivo RPMI El medio RPMI se debe suplementar, por cada 100ml de medio RPMI se añade:   11 ml de suero bovino fetal al 20% (para enriquecer el medio). 0.75 ml de penicilina al 2% (para evitar la contaminación). 1ml e glutamina al 2% (aa esencial para el crecimiento celular). 1.5 ml de buffer hepes (para mantener el pH del medio).

Siembra y cultivo En campana estéril, y para cada cultivo coger 2 tubos de 10 ml (específicos para cultivo), identificar cada tubo con el número de registro y en uno de ellos se debe de poner Be (bromuro de etidio, se le añade para obtener cromosomas con más bandas). Añadir a cada tubo 5 ml de medio. Echar 0.5 ml de muestra en cada uno de los tubos. Añadir 0.15 de fitohemaglutina PHA (mitógeno de linfocitos T). Homogeneizar, poner el tapón y colocarlos en una gradilla inclinada. Meterlos en la estufa de cultivos a 37º C durante 72 horas; cada día se deberán mover suavemente.

Sacrificio / extracción del cultivo A las 72 horas de cultivo: Añadir a cada tubo 0.25 ml de Colcemid (para la división celular en la metafase). Además, al tubo de Be se le añadirá 0.1 ml de bromuro de etidio. Sacar los tubos de la estufa y centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar sobrenadante con una pipeta Pasteur dejando 1 ml. Añadir a cada tubo 5 ml de solución de KCl y ponerlos durante 18 min al baño (37º C). Es para realizar un choque hipotónico, para que las células se hinchen. Centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar el sobrenadante con una pipeta evitando tocar el pellet celular. Preparar la solución fijadora Carnoy en l momento (metanol/ac acético, en proporción 1:3). Realizar con la solución de Carnoy 4 lavados del pellet, cada uno seguido de centrifugación y decantado. En el último lavado, se decanta y resuspende el botón manualmente, añadiendo 1-2 ml de Carnoy, dependiendo del tamaño del pellet celular.

Extensión en portaobjetos Impregnar el portaobjetos con una solución fijadora de Ac acético al 45%. Realizar la extensión “tirando” la gota de muestra.

Visualización microscopica de las preparaciones para su clasificación Con microscopio de contraste de fases y objetivo de 10X, se verifica la calidad de las preparaciones. Una buena preparación debe tener un número suficiente de metafases bien extendidas y libres de citoplasma. Influye la temperatura, la humedad y el choque hipotónico. La alta temperatura y la humedad favorecen las buenas extensiones, así como la altura desde la que se realiza la extensión. Una vez realizadas las extensiones, se colocan a 371 C en estufa. Se dejan envejecer 1 semana aproximadamente, hasta su posterior tinción.

Tinción de la muestra Una vez que las extensiones han envejecido en la estufa se procede a tratarlas para su posterior análisis. Se coloca el porta en una solución de sales de citrato de sodio durante 10 min. Se lavan con agua y se sumergen en tripsina durante 6 seg y se vuelven a lavar. Y se tiñen durante 1,5 min. El colorante se prepara con una mezcla de 2 ml de Wrigh, 3 ml de Sorensen y 3 ml de buffer. Se lavan, se dejan secar y se meten en xilol para limpiar la preparación de posibles residuos.

Análisis de la muestra Se mira la preparación en el microscopio con el objetivo de 10X. Cuando se encuentra una metafase abierta se cambia de objetivo al de 100X con aceite de inmersión. Se deben observar del orden de 15-30 metafases para ver si existe alguna alteración. Cuando vayamos encontrando las metafases vamos apuntando en una hoja las coordenadas para luego encontrarlas en el cytovisión. En el cytovisión se coloca el porta y se pone en las coordenadas que hemos apuntado antes. Se mira con el microscopio de contraste de fases con el objetivo de 10X y después con el de 100X.

Con un programa informático se hace una foto a lo que hay en el porta y se ajusta la luz hasta que se vean claramente los cromosomas y sus bandas. El cariotipador se encarga de realizar un agrupamiento automático, pero no todos los cromosomas se agrupan correctamente, es entonces cuando los tenemos que colocar manualmente. Una vez realizado el cariotipo se imprime y se lleva a los médicos correspondientes.

Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su longitud y a la posición del centrómero. De esta manera, el cariotipo humano queda formado así: Grupo A: Se encuentran los pares cromosómicos 1, 2 y 3. Se caracterizan por ser cromosomas muy grandes, casi metacéntricos. En concreto, 1 y 3 metacéntricos; 2 submetacéntrico. Grupo B: Se encuentran los pares cromosómicos 4 y 5. Se trata de cromosomas grandes y submetacéntricos (con dos brazos muy diferentes en tamaño). Grupo C: Se encuentran los pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Son cromosomas medianos submetacéntricos. Grupo D: Se encuentran los pares cromosómicos 13, 14 y 15. Se caracterizan por ser cromosomas medianos acrocéntricos con satélites.

Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18 Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18. Son cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17 y 18. Grupo F: Se encuentran los pares cromosómicos 19 y 20. Se trata de cromosomas pequeños y metacéntricos. Grupo G: Se encuentran los pares cromosómicos 21, 22, Y. Se caracterizan por ser cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con satélites). Mediante el cariotipado se pueden analizar anomalías numéricas y estructurales, cosa que sería muy difícil de observar mediante genética mendeliana.

Trisomia del Par 21.