Técnicas en citogenética

Presentación del tema: "Técnicas en citogenética"— Transcripción de la presentación:

1 Técnicas en citogenética
Paola Beneit Villena 14/dic/2010

2 Citogenética Convencional
Estudio citogenético convencional de las neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética: Estudio de los cromosomas de las células hematopoyéticas en su fase de máxima concentración (metafase) Cariotipo: Ordenación de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales

3 Ventajas En un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con información de todos los cromosomas Bajo coste económico Disponibilidad Alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales Significación clínica establecida

4 Inconvenientes Requiere cultivo de tejido fresco
Analiza células sólo en división Lenta en tumores sólidos (2 semanas), aunque en neos hematológicas, se puede en 24-72h Precisa personal experimentado Baja sensibilidad Poco poder de resolución en alteraciones cromosómicas complejas, microdelecciones, …

5 ¡Intentar máximas condiciones de asepsia!
Muestras Médula Ósea extraída mediante punción esternal o de cresta ilíaca, en un tubo estéril de heparina sódica Sangre Periférica extraída en un tubo de 10ml de heparina sódica Biopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivo ¡Intentar máximas condiciones de asepsia!

6 Siembra En primer lugar, se realiza la siembra de los cultivos en condiciones estériles en la cámara de flujo laminar Se siembran 0.5 ml en dos Falcons de cultivo estéril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a -20ºC) Según dx de la muestra, se cultiva 24-72h, con o sin TPA TPA: Phorbol 12-myristate 13-acetate, mitogeno q estimula el crecimiento celular Camaras con aire libre de particulas y de contaminantes

7 Orientación Diagnóstica
Tipo de Muestra Tipo de Cultivo Mitógenos [ ] y tiempo de Colcemid SMD MÓ o SP 24/48h 24h + MTX ____________ (0,1g/ml) 30’ SMPC LAM LAL Directo/24h 2 h SLPC/LNH SP o MÓ 72h TPA (estimulación de línea B) PHA (estimulación de línea T) (0,15g/ml) 2h Ganglio/bazo/ exudado/ masa tumoral 24h: Sin estimulación celular 48/72h: Con mitógeno TPA/PHA 20’ (sin estimular) (0,15g/ml) 2h (estimulado) MM MÓ 48/72h: Sin estimulación 120h: Con IL-4 20’ El MTX es un antagonista del ácido fólico que bloquea la síntesis de ADN en la fase S, bloqueando por tanto el ciclo celular.

8 Sacrificio de los cultivos
Añadir 0.1 ml del antimitótico Colcemid y se deja en estufa de CO2 a 37ºC durante 30’ las mieloblásticas (LAM, LMC, SMD, SMPC) 2º las linfoblásticas (SLPC, LNH) Pasamos el contenido a un tubo de centrífuga, y lo centrifugamos 10’ a 1200 rpm Posteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botón (pellet) y resuspendemos Choque Osmótico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30’ al baño maría (37ºC) Las condiciones del cultivo : temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son característicos de cada línea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%. Las metafases se obtienen utilizando colcemid, que actúa sobre el citoesqueleto, impidiendo que polimericen, por lo que no se forma el huso mitótico, y este es el motivo por el cual las células permanecen en metafase

9 Sacrificio de los cultivos
Centrifugamos, decantamos, y se añaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:ácido acético 3:1) agitando. 10’ a temperatura ambiente Repetimos el paso anterior, dejando 30’ en nevera Centrifugamos, decantamos, y añadimos 1ml de Carnoy Resuspendemos y pasamos a un tubo NUP El Carnoy tiene que estar recién preparado

10 Portaobjetos Porta previamente guardado a 4ºC con metanol. Secamos,
cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 ó 2 gotas de la preparación. Se flamea y se deja secar Miramos en microscopio invertido para ver la densidad celular y la extensión de los cromosomas Se hacen 4 extensiones de cada cultivo 24h en estufa de desecación a 60ºC, para envejecer El metanol es para desengrasar.

11 Portaobjetos Para la tinción Se cubren
Solución de tripsina 12 segundos Lavamos con PBS 2 segundos Giemsa al 5% 5 minutos Lavar y mirar al microscopio Se cubren Metafer® para seleccionar metafases Tripsina: Proteasa que rompe las uniones intercelulares Buscas una metafase, miras como están los cromosomas y ves si tienen bandas y no están deflecados. Si ok, hacer el resto, y dejar secar al aire. Si deflecados, reducir el tiempo de tripsina 1 segundo cada vez. Si no se ven las bandas, aumentar el tiempo de Giemsa 1 minuto cada vez. *2 Eliminando burbujas con la punta de una pipeta

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17 2x24h + ADN + ARN + Criopreserv. Sí CYTOCELL
Leucemias agudas Momento Cultivo Cariotipo FISH LAM Dx 2x24h + ADN + ARN + Criopreserv. Sí CYTOCELL Evolución 2x24h Consultar Pre/Post Tx LAM INFANTIL 7, 8, MLL LAM (día sig.) 24h + 48h LAP 1x24h + 1x48h PML/RARα Recaída LAL Dx - Adultos BCR/ABL + MLL Dx - Niños BCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2A Todo en Médula Ósea

18 Del(5q) PML/RARα 1º, más frecuente en SMD y LAM
2º, t(15;17), en 98% M3 PML/RARα

19 Delección p53 AML1/ETO 1º, LLC B
2º, t(8,21), 40% M2, menos frecuente en M1 y M4 AML1/ETO

20 MLL Del(7q) 1º, 85% LAL-B infantiles. T(4;11)
2º, frecuente en SMD y LAM en adultos y niños. En niños en LMC juvenil. Asociado a LAM asociadas a enfermedades geneticas constitucionales. Del(7q)

21 MYH11/CBFβ Del(20q) La 1ª, inv(16), en 20% de las M4
La 2ª, en SMD y LAM, en un 5 y 1% respectivamente. 10% PV Del(20q)

22 SMD y SMPC Momento Cultivo Cariotipo FISH
Dx 2x24h Sí 5q- Evolución Consultar Pre/Post Tx SMPC BCR-ABL (SP) LMC LMMC 2x24h + ADN + ARN PDGFR α y β* + BCR-ABL No O pancitopenia, o bicitopenia, o displasia *(5q32) * Receptor alfa/beta del factor de crecimiento derivado de las plaquetas

23 Fragilidad Cromósomica 2x72h + PHA 2x72h + DPB 2x72h + 10 MTC
SLPC Momento Cultivo Cariotipo FISH SLPC-B Dx 2x72h + TPA No FISH LLC + IgH LLC SLPC-T 2x72h + PHA LINFOMAS Momento Cultivo Cariotipo FISH Manto Dx 2x72h + TPA No BCL-1 Folicular BCL-2 No definido 2x72h + PHA IgH Hodking Fish LLC: CEP12, ATM, D13S319/S25, p53, IgH O pancitopenia, o bicitopenia, o displasia * (5q32) OTROS Momento Cultivo Cariotipo FISH Anemia Aplásica Dx 2x24h Sí 7q- Fragilidad Cromósomica 2x72h + PHA 2x72h + DPB 2x72h + 10 MTC 2x72h + 40 MTC No

24 Técnica de fish

25 FISH Complemento de la técnica de citogenética
Hibridación in situ: Marcar o identificar una secuencia de ADN con una sonda específica que reconoce dicha secuencia Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, específicas, que reconocen una determinada secuencia del genoma

26 FISH Alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales tanto en células que no entran en división (interfase) como en células en división (metafase) La mayoría de los dx hematológicos se asocian a una alteración citogenética determinada Confirmación de dx clínicos, caracterizar grupos pronósticos y realizar monitorización de EMR Valoración del quimerismo hematopoyético tras el trasplante de médula ósea alogénico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptor El estudio cromosómico de las neoplasias hematológicas aporta información necesaria para caracterizar determinados casos clínicos.

27 FISH Menor S que otras técnicas moleculares
Identificación de anomalías cromosómicas crípticas o difíciles de detectar para la citogenética convencional Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo Técnica sencilla y rápida En determinados casos, en 4-5h se puede tener un dx Una célula normal puede mostrar el patrón de hibridación de una célula tumoral. Por ello hay q calcular el “error intrínseco”, con muestras de individuos sanos. Se ve el patrón d ehibridación que genere la sonda utilizada en células normales y anormales. Cuanto más complejor es el patrón de la célula afecta, más improbable será que se produzca por azar en una célula normal.

28 FISH Puede aplicarse en células depositadas en un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugación…) hasta cortes de tejido incluidos en parafina Se ha usado esta técnica para muestras en parafina almacenadas durante años (hasta 12) a tª ambiente Técnica de elección (por delante de la PCR) para búsqueda de translocaciones que involucran a genes “promiscuos”, y para delecciones en MM, LLC… Reordenar con varios genes, Como MLL o IgH

29 Variantes Variantes tecnológicas Aplicaciones crecientes
Hibridación genómica comparada (CGH) Cariotipo espectral (SKY-FISH) Multiplex FISH (M-FISH) Aplicaciones crecientes

30 Variantes (M-FISH y SKY-FISH)
Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisión único y diferenciable de lo demás “Se pinta a cada cromosoma de un color” Los cromosomas anómalos aparecerán no uniformes Útil en neos hematológicas Caracteriza correctamente translocaciones complejas y crípticas

31 Ventajas (M-FISH y SKY-FISH)
Permiten analizar todo el genoma Enorme poder de resolución Identificación de segmentos cromosómicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en ≠ patologías)

32 Inconvenientes (M-FISH y SKY-FISH)
Requieren cultivo de tejido fresco Analizan sólo células en división Personal experimentado tanto en la realización como en la interpretación Sensibilidad similar al cariotipo, aunque la información sea más concluyente No detectan delecciones, inversiones o duplicaciones dentro de un cromosoma Elevado coste económico Equipo informático sofisticado Por el momento, sólo se usa en investigación

33 Muestras Preparaciones de citogenética convencional tras cultivo de médula ósea, sangre periférica, ganglio u otros tejidos La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solución Carnoy También es aplicable a extensiones en fresco de muestras biológicas

34 Preparación – Día 1 Extensiones: Eppendorf (donde se ha guardado el material de citogenética convencional) del congelador a -20ºC, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevo Una gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a 40-50ºC Observar extensiones en microscopio invertido a x10 aumentos para ver la distribución de núcleos y el secado Guardar a Tª ambiente 24h Si la muestra es urgente, se puede hibridar en el mismo día, dejando al menos 1h en temperatura ambiente * Rotular siempre en la banda esmerilada las iniciales del paciente y la sonda que se hibrida

35 Hibridación - Día 2 En oscuridad 7 µl de tampón 1 µl de sonda
2 µl de agua destilada Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar según cada sonda (24h normalmente) Tª ambiente Eppendorf estéril Antes de comenzar, Sacar del congelador los tubos de las sondas y el buffer que vayan a emplearse Dar un golpe de centrífuga a los tubos de la sonda y el buffer. Encender el cohibridador (Hybrite, Vysis) y seleccionar el programa adecuado. Añadir tiras de papel secante humedecidas.

36 Lavado y contratinción - Día 3
En oscuridad Lavado post-hibridación Retiramos cubre, lavamos 2’ en un baño a 74ºC con una solución de lavado Posteriomente, lavamos 1’ en una solución de lavado a distinta concentración y a temperatura ambiente Contratinción Poner 10 µl de DAPI II y cubrir Poner a -20ºC en una caja oscura, envueltas en papel de aluminio, como mínimo 30’-1º

37 Microscopio de Fluorescencia
Sondas centroméricas: Mínimo de 200 núcleos, con los núcleos con 1, 2, 3 ó 4 señales de hibridación Trisomía: Si >5% de células con 3 señales Monosomía: Si >15% con 1 señal Sondas de locus específicos: Valorar mínimo de 100 núcleos o de 20 metafases Valorable si >5% de células alteradas Estos resultados varían según S y E de la sonda empleada

38 T(9;22)

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40 T(8;21), LAM M2, buen pronóstico

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42 T(12;21), 25-30% niños con LALB, buen px