Detección de microorganismos en alimentos seguros Esp. Claretzy López M Microbióloga Industrial

DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS SEGUROS El examen microbiológico de los alimentos y sus ingredientes ayudan a valorar: Si son seguros para los consumidores La estabilidad o vida útil en condiciones normales de almacenamiento Grado de higiene aplicada al manipularlos.

La carga microbiológica y el tipo de microorganismos son importantes para: Determinar si un producto y sus ingredientes satisfacen los estándares, especificaciones y lineamientos de aceptabilidad En el caso de productos procesados con calor determinan la fuente y características de contaminación después del tratamiento.

METODOS UTILIZADOS Los métodos empleados para la valoración o detección de microbios en alimentos, sus ingredientes y su entorno se clasifican en dos grandes grupos: Cuantitativos Cualitativos Estos métodos se utilizan para detectar la posible presencia de ciertos patógenos en alimentos: Salmonella, Clostridium botulinum, Esc. Coli, Listeria monocytogenes.

MÉTODOS CUANTITATIVOS Estructurados para determinar o calcular de manera directa o indirecta, la carga microbiana del material analizado. Directo Indirecto Ejm: Recuento de aerobios en placa de petri Recuento de anaerobios Recuento de microorganismos Termorresistente Conteo de coliformes Conteo de hongos y levaduras

CONTEO DIRECTO 1.Microscopio de contraste de fase se evidencian células coloreadas. Reportar los resultados como cuenta microscópica por ml o g del producto. Reportar los resultados como cuenta microscópica por ml o g del producto.

DESVENTAJA: No se diferencia entre células vivas o muertas; no se puede realizan en los alimentos que contienen partículas, a demás la muestra debe contener más de 106 microorganismos por ml o g. Actualmente: equipo LIVE BacLight Gram stain. Donde es posible el conteo de bacterias vivas, Gram (+/-) por medio de fluorescencia.

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) 2. En medios de agar no selectivos: agar plate count, tripsina soya, agar nutritivo, agar cerebro corazón. Ej: mesófilos aerobios 37°C 48h; Psicrotrófos 7°C 10 días y 10°C 7 días. El reporte estará basado en el número de colonias presentes.

En medios diferenciales no selectivos: Adicionar componentes para diferenciar características que las hacen particulares. Ej: indicador de pH púrpura de bromocresol, sustancias como fuente de carbono como la lactosa, yema de huevo.

El reporte de UFC estará enfocado en las manifestaciones microscópicas del grupo bacteriano. En medio de agar selectivo: se agrega uno a mas inhibidores como antibióticos o sales donde sólo pueda proliferar los microorganismos que sean resistentes a ellos.

CONTEO INDIRECTO 1. Diluciones hasta a extinción en caldos no selectivos: consiste en preparar diluciones seriadas de una muestra y transferir 1ml o 0.1 a 10ml de un caldo final no selectivo como el tripticasa soya.

Se examinan los tubos para observar si hubo proliferación bacteriana según la turbidez del medio. El reporte dependerá de la cantidad de microorganismos presentes a partir de la máxima dilución de muestra con la que se produce multiplicación microbiana. Ej: turbidez en la dilución 10-6=1000000 células por ml / g.

2. Conteo más probable en caldo selectivo: Se inocula en un caldo contenido en tubos de ensayo, se realizan diluciones seriadas de la muestra; El caldo contiene uno o más agentes que propician la proliferación de grupos bacterianos en un alimento. Se utilizan de 3 a 5 tubos de caldo en cada dilución y un mínimo de 3 diluciones consecutivas.

Se incuban adecuadamente y a partir del número de tubos con diluciones consecutivas en los que se observe multiplicación microbiana se emitirá un resultado. Tabla de NMP. Es usada con frecuencia para calcular coliformes totales y Fecales en alimentos y en agua empleados habitualmente caldo Brillante-bilis-lactosa y caldo E-C.

3. Prueba de reducción de colorantes : Basado en el principio que algunos colorantes, como azul de metileno tiene un color en estado de oxidación, pero son incoloros en estado de reducción (directamente proporcional con la carga bacteriana del producto).

4. Conteo de grupos de microbios lesionados por medios selectivos: En el caso de coliformes y células bacterianas patógenas con lesiones subletales, los microorganismos pueden morir durante el conteo en medio de agar selectivo, ya que desarrollan sensibilidad a los agentes agregados.

Métodos cualitativos Están diseñados para determinar si un material representativo (muestra) de un alimento o cierto numero de muestras de un lote contiene o no una especie microbiana específica.

METODOS CUALITATIVOS PARA AISLAR MICROORGANISMOS 1. Aislamiento de patógenos: determinar si una muestra contiene o no, células o esporas viables de un patógeno específico. (Salmonella, Listeria, Vibrio y Shigella

El proceso de aislamiento Enriquecimiento previo no selectivo: reparar células lesionadas o estresadas y proliferen hasta una cantidad medible. Enriquecimiento selectivo: proliferación del patógeno específico y multiplicación abundante Diferenciación e identificación: desarrollo de colonias características del patógeno y realización de pruebas bioquímicas preliminares y serológicas confirmativas.

Análisis en busca de toxinas bacterianas en alimentos: Tipos de toxinas: Enterotoxina: S.aureus- Elisa –RIA (radio inmunoanàisis) Neurotoxina botulinica: C. botulinum

METODOS ESTANDAR RECOMENDADOS Aquellos métodos aprobados por entidades gubernamentales: son métodos estándares o recomendados. Publicaciones estándar Estados unidos: American Public Health Association FDA y AOAC. Bacteriological analytical manual of food and drug administration

Organizaciones internacionales WHO Organización Mundial de la Salud FAO Organización de alimentos y de Agricultura de las Naciones Unidas

MUESTREOS PARA ANALISIS MICROBIOLÒGICO Las muestras y la toma de muestras Muestra: porción analizada, la cual debe ser representativa de todo el conjunto. Muestreo: método eficaz de toma de muestra .

PLANES DE MUESTREO ESTANDAR Y RECOMENDADO

Plan para un solo atributo en este se tomo una sola muestra del lote, la cual es examinada en busca de la bacteria. Se utilizan los resultados para determinar si hay que rechazar o aceptar el lote según contenga o no Esc. Coli. las muestras se clasifican en dos clases ( admisibles o rechazables ). El objetivo de este tipo de análisis es poner de manifiesto la presencia/ausencia de un determinado microorganismo , o también comprobar que el número de microorganismos presentes en esa muestra es mayor que el especificado en el criterio.

Planes de muestreo por variables Se emplean cuando se puede asumir que los microorganismos se distribuyen en lote de modo normalmente logarítmico. Ejemplo: cuando el lote se prepara con condiciones muy uniformes .

Plan para bajos niveles de contaminación Es importante para el caso de patógenos muy agresivos. Según sea el tamaño del lote, se analiza un número de unidades para determinar si contiene o no un patógeno, y tomar la decisión de aceptar o rechazar el lote.

PROCEDIMIENTO DE MUESTREO VARIABLES Conocer el tipo de análisis al cual se someterá el producto. Procedencia de la muestra ( brote de enfermedad, evaluación de proveedores) Características del producto (líquido, sólido, semisólido, congelado, varias unidades).

Realizar procedimiento de forma aséptica y medidas sanitarias adecuadas para evitar falsos positivos y poder asegurar que sea posible repetir el análisis con la muestra sobrante. después de tomar las muestras y hasta que sean examinadas, las muestras no deben ser manipuladas para evitar la proliferación o la muerte de los microorganismos

Es necesario etiquetar cada muestra para identificar fecha, tiempo, características, tipo de examen, responsable del muestreo. Transportar las muestras al laboratorio en condiciones adecuadas para impedir contaminación o muerte del microorganismo.

MÉTODOS RÁPIDOS Y AUTOMATIZACIÓN Lo métodos convencionales tienen como referencia para la detección de patógenos los cultivos. Los métodos rápidos se crearon para: Detectar patógenos Cargas bacterianas Toxinas Verificar los controles del proceso de manufactura Vigilar las prácticas de limpieza e higiene utilizadas en cada planta.

VENTAJAS Son rápidos Sensibles Específicos Requieren menos trabajo Entrega oportuna de desviaciones de proceso

Características metabólicas distintivas: Se utilizan placas de petri con pocillos que incluyen diferentes sustratos. Azucares o aminoácidos. Los cuales a portan las necesidades básicas para la proliferación y supervivencia componente Función azucares Fuente de carbono aminoácidos Fuente de nitrógeno nutrientes síntesis de material celular y la obtención de energía Las peptonas y los extractos de carne y de levadura. fuente de nitrógeno, fósforo y azufre orgánicos

TÉCNICAS DE NANOTECNOLOGÍA Aque detectan complejos biológicos o químicos formados por Ag-Ac, Enzima- sustrato identificado por una señal eléctrica.

TÉCNICAS DE NANOTECNOLOGÍA Biosensores de fibra óptica: generación de ondas coloreadas manifestando presencia del metabolito : toxinas ( S.aures, B. anthracis, C,botulinum.), patogeno ( Listeria, campilobacter, E.coli y Salmonella), micotoxina ( Ocratoxina A, Aflatxina B, Fumosina B,

Inmunosensor electroquimico: basados en reaccion Ag-AC enzima conjuada Sensor de biochip ( mide cambio de carga electrica una vez hay proliferación micorbiana en el medio.

Sensores celulares : sirve como transductor al emitir una señal específica durante su interacción con el analito investigado. Sensores de resonancia: instrumento que permite cuantificar la cinética de enlace de dos moléculas sin marcadores fluorescentes.

El limite inferior de detección de células bacterianas es de 103 a 104 UFC/ml El limite de toxinas en concentración de nano gramo.

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