VENENO TOTAL Bothriechis schlegelii Pruebas de actividad bioquímica Caracterización bioquímica del veneno de Bothriechis schlegelii (Serpientes: Viperidae) 1Leonel Montealegre, 1,2Nora Céspedes, 2Eliecer Jiménez, 3Diana Hermith 4Fernando Castro, 1,2Myriam Arévalo-Herrera y 1,2Sócrates Herrera 1 Instituto de Inmunología, Universidad del Valle, Calle 4B No 36 – 00 Cali, Colombia 2Centro Internacional de Vacunas, Cra. 37 – 2Bis No. 5E-08 , AA 26020 Cali, Colombia 3Programa de Biologia, Departamento de Ciencias, Naturales y Matematicas, Pontificia Universidad Javeriana 4 Grupo de Herpetología, Universidad del Valle , Calle 13 No 100-00 Cali, Colombia . Pontificia Universidad Javeriana-Cali Dirección Académica General Coordinación Institucional de Investigación Diseño experimental Introducción El accidente ofídico es un problema de salud global y en Latinoamérica el envenenamiento botrópico es el caso mas frecuente. En Colombia, el Instituto Nacional de Salud (2007) estima una incidencia de aproximadamente 7 accidentes ofídicos por cada 100.000 habitantes, los cuales son causados en su mayoría por especies de la familia Viperidae (alrededor del 90% de los casos). En general, el cuadro clínico que se desarrolla está asociado con daños locales rápidos y prominentes (edema, dolor, sangrado, necrosis), seguidos de alteraciones sistémicas como coagulopatías, choque cardiovascular e insuficiencia renal aguda. El presente trabajo fue realizado por el Centro Internacional de Vacunas en conjunto con el programa de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana. VENENO TOTAL Bothriechis schlegelii caracterización Pruebas de actividad bioquímica Perfiles proteicos In vivo SDS-PAGE Letalidad (DL50) In vivo 2-DE Edematizante Los efectos tóxicos de las mordeduras de serpiente se deben al contenido de sus venenos, los cuales son mezclas complejas de componentes como polipéptidos y proteínas hidrofílicas. Algunas de estas proteínas presentan actividad enzimática y pueden contribuir a la acción digestiva del veneno (Tabla 1). Sin embargo, en Colombia se conoce poco acerca de las propiedades químicas y funcionales de los venenos. Esta situación es evidente en el caso particular de la especie Bothriechis schlegelii, con la cual se reportan entre el 5-10% de los accidentes en el país. Tabla 1. Efectos farmacológicos de las toxinas presentes en los venenos de serpientes. In vivo HPLC Desfibrinante In vivo Hemorrágica Fracciones In vitro Coagulante Identificación In vitro Hemolítica Indirecta LC/MS/MS Resultados Existe variación individual en la composición proteica (Figura 2) y en la funcionalidad (Figuras 3 y 4, Tabla 2) de los venenos de B. schlegelii Los venenos de B. schlegelii analizados son hemolíticos, con actividad coagulante y desarrollan edema pronunciado a los pocos minutos de la inoculación. No producen hemorragia ni poseen actividad desfibrinante. COMPONENTE EFECTO Glucoproteinas Reacciones anafilácticas Proteinas de alto peso molecular Polipeptidos Neurotoxinas Cardiotoxinas Paralisis respiratoria Depresion cardiovascular Proteinas enzimáticas Proteasas Fosfolipasas Metalloproteinasas Proteasas de serina Acetilcolinestarasas Miotoxinas Citolisis Hemolisis Inhibicion y/o activacion de la coagulación Hemorrágias Hipotension arterial Fallas renales agudas CINÉTICA ACTIVIDAD EDEMATIZANTE MP Hembra 1 Hembra 2 Macho 250kDa 150 100 75 50 37 25 20 15 Control Hembra 1 Hembra 2 Macho Figura 3. Actividad edematizante de los venenos de B. schlegelii en el transcurso de un día. Tabla 2. Resultados de las actividades desfibrinante y coagulante de los venenos de B. schlegelii ACTIVIDAD Hembra 1 Hembra 2 Macho Desfibrinante Ausente Coagulante (DCM)1 84µg 82µg 155µg Bothriechis schlegelii (Viperidae) B A Figura 2. SDS-PAGE venenos B. schlegelii 1DCM = Dosis Coagulante Mínima = Cantidad de veneno (µg) que produce coagulación de plasma humano citratado en 60 segundos. MP DHeIM2 -> 8.1µg Hembra 2 DHeIM2 -> 25.6µg Macho DHeIM2 -> 3.4µg Hembra 1 Figura 1. A) Distribución geográfica de B. schlegelii en Colombia. Modificado de Campbell & Lamar (1989). B) Ejemplares de la especie B. schlegelii. Figura 4. Actividad Hemolítica Indirecta de los venenos de B. schlegelii. 2 DHeIM: Dosis Hemolítica Indirecta Mínima = Cantidad de veneno (µg) que produce halo hemolítico de 20mm de diámetro. Bothriechis schlegelii es una especie que se caracteriza por tener una amplia distribución a lo largo de América Central y Colombia (Figura 1). Tiene un estilo de vida arbóreo y se alimenta de ranas, lagartos, pequeñas aves y roedores. Los resultados del presente trabajo son preliminares, sin embargo representan un avance muy importante en el conocimiento de la composición y efecto de los venenos de serpientes de la especie B. schlegelii procedentes del suroccidente de Colombia, teniendo en cuenta la alta variabilidad encontrada en los venenos de esta especie alrededor de Latinoamérica. pET24a B1 B3 pET24 + Nde I pET 24 + Xho I Objetivos Determinar los perfiles de proteínas de venenos de B. schlegelii. Evaluar la actividad funcional de venenos de serpientes B. schlegelii, de acuerdo con el cuadro clínico general que desarrollan los venenos de las serpientes de la familia Viperidae. 381 pb 375 pb 306 pb Perspectivas Determinar e identificar las proteínas responsables de la actividad funcional observada en los venenos de B. schlegelii. Evaluar la capacidad de anticuerpos generados contra el veneno de neutralizar cada uno de los efectos encontrados.