REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Amplificación enzimática de un fragmento de DNA (simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

Eventos en la Replicación del DNA: Apertura de las cadenas (origen de replicación) Colocación de los iniciadores (primers de RNA) Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores) Eliminación de los iniciadores de RNA. Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)

Fundamento de la técnica

Componentes  Desoxinucleotidos (dNTPs) : dATP, dTTP, dGTP, dCTP Pueden utilizarse marcados con 32 P, quimiolumisiscentes o fluorescentes para que el producto del PCR se use como sonda

Componentes Polimerasas Dirección de polimerización 5’-3’. Necesita 3’-OH. Copian molde. Usan dNTP TaqThermus aquaticus VentThermococcus litoralis PfuPyrococcus furiosus TthThermus thermophilus DNA polimerasa Origen Vida Exo 5´ Exo 3´ Transcriptasa Media reversa

Componentes La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento  Dos oligonucleótidos, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN.  únicos: Asegura alta especificidad  Complementarios a la cadena de ADN  Tamaño de nucleótidos  Diseño: 3’-OH bien apareado  Temperaturas de anneling (ºTm)  La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs) 5’ 3’ 5’

Procesamiento

Etapas de la PCR Denaturación 94 o C Anillaje o C Extension 72 o C Temperatura Tiempo 30 ciclos 1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena 2. Alineamiento: Anillaje de primers 3. Extensión: Generación de la nueva cadena

El número de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR El número de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR Numero de ciclos Numero de copias

Electroforesis Separación de moléculas en un campo eléctrico Cámara de electroforesis Electrodo (+) Electrodo (-) Camas para preparación del gel de agarosa Fuente de poder

Tinción con Bromuro de etidio Agente intercalante Bromuro de Etidio Molécula fluorescente que se intercala entre las bases de la molécula de DNA Absorción a 330 nm (UV)emisión en luz visible

Bandas Inespecíficas Corrido de electroforesis con bandas inespecíficas Bandas definidas con diferentes pesos moleculares

Técnicas derivadas/ basadas en PCR  PCR Nested Amplificación de una secuencia dentro de otro previamente amplificada  PCR Multiplex Varios targets diferentes en forma simultánea  PCR-RFLP Polimorfismo genético  RT-PCR Detección de mRNA  Real Time PCR Cuantificación de copias iniciales en tiempo real

SEGUNDA PCR 1 Reacción Primers externos para amplificación de una secuencia extensa 2 Reacción Primers internos para amplificación de una región especifica PCR Nested (anidada) PCR Nested (anidada) Dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers Genera mayor ESPECIFICIDAD

PCR Multiplex Amplificación de varias secuencias de forma simultanea Diferentes set de primers Tamaño del amplicon

RFLPs Restriction fragment length polymorphism Estudios de polimorfismos: variación en la secuencia de ADN METODOLOGIA 1.Extracción de ADN 2.PCR – se obtiene la secuencia target 3.Digestión con enzimas de restricción  mecanismo de defensa de bacterias 4.Electroforesis en gel

Hae III corta: GGCC GGTCGGCC 5'3' 5'3' CCGG CCGG CCGG CCGG CCGG 5’ GGCC 3’ Cambios en el sitio de restricción

mRNA cDNA PCR ) RT-PCR (Retro-transcripción) Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA Enzima mRNA—cDNA : Retro-transcriptasa Primers Enzima Taq pol

PCR en tiempo real  La técnica PCR combina la amplificación del DNA con cuantificación de los productos en un solo tubo.  “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que se van generando  Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes.  La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

Cuantificación absoluta Comparación con productos amplificados de los cuales se conoce el número absoluto de moléculas iníciales (estándares).

El número de moléculas en una muestra desconocida es calculado por la extrapolación de los datos obtenidos con la curva estándar, generando valores absolutos que pueden ser:  Número de copias  Concentración: ng/ul

 Con base en la existencia de un gen normalizador se estima la cuantificación relativa de expresión del gen de interés.  La cuantificación relativa determina los cambios en los niveles de mRNA de un gen expresándolos en relación a los niveles de expresión de un control interno. Cuantificación Relativa

Características de un Buen Gen Normalizador Bajo ninguna condición su expresión se debe alterar Su expresión no puede ser muy distante de la del gen o genes en estudio La estabilidad y tamaño del amplificado deben ser similares a los del genes en estudio

Aplicaciones de la PCR Diagnostico de enfermedades Establecimiento de la huella genética Secuenciación Mutagénesis Filogenia Identificación de sitios de recombinación por inserción Identificación de género y especie

ESQUEMA DEL MÉTODO PARA IDENTIFICAR EL SITIO INSERCIÓN DEL miniTn10Km R Kown, et al., 2000)