Cultivos Microbianos Dr. Claudio Voget Curso CABBIO, Noviembre 2005

Relaciones entre nutrición, metabolismo y crecimiento h h h Excepto algunos átomos de C de los nucleótidos, la asimilación del C deriva de 8 intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato, acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato.

Conceptos básicos de cinética microbiana qi velocidad específica de consumo de sustrato o formación de producto (qi mmol/ g biomasa x h ) ri velocidad volumétrica de consumo de sustrato o formación de producto ri ( mmol/ litro x h ) qO2 qS qp qCO2 µ O2 S CO2 P ri = qi * X X concentración de biomasa V estado fisiológico de la célula (flujos metabólicos) rO2 = qO2 * X Los rendimientos pueden expresarse como cociente de velocidades !

Rendimientos verdaderos y mantenimiento d1 CH2O + α1 NH3 + β1 O2  g1 biomasa + δ1CO2 + w1H2O + Δh1 d2 CH2O + α2 NH3 + β2 O2  s2 producto + δ2 CO2 + w2H2O + Δh2 d3 CH2O + β3 O2  mantenimiento + δ3 CO2 + w3 H2O + Δh3 Rendimientos verdaderos rx rsx rp rsp rsm rs S rN NH3 rO2 O2 (d1+d2+d3) = d , (α1+ α2) =α , (β1+ β2+ β3) = β , (δ1+ δ2+ δ3) = δ, Si d=1  α=a, β=b, δ= yco2/s CH2O + a NH3 + b O2 yx/s biomasa + yp/s producto + yco2/s CO2 + w H20 + Δh Rendimientos experimentales rs ,rO2 rx , rp

Ecuación lineal de consumo de sustrato (ELCS) rp = 0 ms = 0.05 g glucosa / g biomasa x h µ (h-1) yx/s / y´x/s 0.05 0,645 0.1 0,78 0.3 0,92

Factores que afectan la velocidad de crecimiento (µ) Ecuación de Monod µ = f(S) Temperatura pH øH2O Composición del medio qs qi µ Sext Sint E membrana celular ≡ S (g/l) cultivo restricto cultivo irrestricto µ ≠ f(S) Ks = ug a mg/l

Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana Crecimiento de Saccharomyces cereviseae El metabolismo de S cereviseae es netamente oxidativo hasta una µ de 0.2-0.25 h-1. Por encima de este valor se induce la fermentación alcohólica dando lugar a un metabolismo mixto oxidativo-fermentativo. El rendimiento celular disminuye. La producción aeróbica de etanol en S. cereviseae se denomina Efecto Crabtree µ < µcrit µ > µcrit

Efecto de µ y el sustrato limitante en la fisiología microbiana Parámetros de crecimiento y actividad β-galactosidasa Cultivo Continuo (µ = 0.1 h-1) Nutriente limitante Yx/s g/g Actividad LAU/mg Carbohidratos totales % Proteína % Glucosa 0.44 0.19 30 42.5 Lactosa 0.47 18 43.5 Amonio 0.38 3.2 52 29 Batch (fase estacionaria) 0.40 4.3 - Cepa: K. Lactis NRRL 1118, 30 ºC, pH 4.7, Medio definido

Sistemas de cultivo Los procesos fermentativos pueden dividirse básicamente en 2 grandes grupos Fermentaciones líquidas sumergidas (FLS) Contenido de agua del medio 90-95 % Fermentaciones en sustrato sólido (FSS) El medio son partículas húmedas con ausencia o casi ausencia de agua libre

Reactores empleados en fermentaciones líquidas sumergidas

Fermentación en sustrato sólido Hay dos formas básicas de cultivos sólidos Cultivos en sustratos naturales (granos, residuos agroindustriales) Cultivos con soportes inertes impregnados con medio nutritivo (inertes: perlita, hemp, bagazo, poliuretano) Comparación a nivel de microescala entre FLS y FSS

Tipos de reactores empleados en fermentaciones en sustrato sólido

Comparación entre FSS y fermentación líquida sumergida Fermentación sumergida Medios simples. Requieren adición de agua o una solución mineral. Sustratos variables Medios con mayor cantidad de ingredientes, mayor costo. Buena reproducibilidad en medios definidos Bajo øH20 reduce riesgos de contaminación Mayores riesgos de contaminación Medios concentrados. Elevada concentración de producto Menor volumen de reactor Medios diluídos, Volúmenes de fermentación grandes. Altas concentraciones de medio puede afectar crecimiento. Alimentación de sustrato es común Menor consumo de energia para aerear Transferencia G-L es generalmente limitante Mezclado imperfecto o casi imposible. Difusión puede limitar el proceso Mezclado intenso. La difusión de nutrientes es generalmente no limitante Remoción de calor es crítica. Transferencia de calor por evaporación puede ser importante Alto contenido de agua facilita control de Tra Control del proceso dificultosa. Estimación de biomasa no es directa Amplio desarrollo en sistemas de medición y control Downstream processing simple. Contaminación de producto con componentes del medio es alta Bajos volúmenes de efluentes líquidos La remoción de grandes volúmenes de agua aumenta costos en los procesos de separación y purificación Cinética y fenómenos de transporte poco conocidos Modelos cinéticos y difusionales

Operación de reactores Co, Fo, C, FS VL C Yo, Fgo Y, Fgs VG Y Ecuaciones de balance interfase G-L Fase líquida Fase gaseosa

Cultivo Batch Es el cultivo mas simple Volumen constante Cerrado para fase líquida Fo = Fs = 0 Composición inicial del medio determina el curso del cultivo inóculo Fase exponencial

Cultivo Batch ó Balance para biomasa estacionaria desaceleración m (pendiente) = µmax exponencial Lag

Velocidades de crecimiento de microorganismos y células Cultivo µ (h-1) tiempo de duplicación (h) bacterias 0,6-1,4 0,5-1,15 levaduras y hongos filamentosos 0,2-0,6 1,15-3,0 células animales 0,01-0,04 17-70 células vegetales 0,007-0,03 23-100

Fase de desaceleración y estacionaria Puede deberse a inhibición por producto, agotamiento de nutrientes, limitación por oxígeno En medios complejos la fase de desaceleración es mas extendida en comparación con medios definidos. La característica de la biomasa al final del batch puede ser controlada con la composición inicial del medio (el cultivo puede limitarse en C, N, P, etc) En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a la falta de nutrientes (condición de starvation): supervivencia prolongada, incremento en la resistencia a condiciones de stress (salino, térmico, oxidativo, osmótico), etc. Hay expresión diferencial de genes al entrar al estado estacionario Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se mantienen viables (viables no cultivables)

Desventajas del cultivo batch Dificultad de controlar el µ, excepto variando la composición del medio o las condiciones de proceso Altas concentraciones de nutrientes pueden inhibir el crecimiento debido al aumento de la presión osmótica del medio o toxicidad de nutrientes Alta demanda de oxígeno puede generar una limitación debido a una insuficiente capacidad del reactor para transferir O2 al medio Inconvenientes para remover calor Tiempos muertos entre procesos disminuye la productividad. Pie de cuba

Cultivo continuo El tipo básico es el quimiostato, que consiste en una suspensión celular perfectamente mezclada a la cual se adiciona medio fresco a una velocidad constante y se retira cultivo a igual velocidad, de este modo el VL es cte. La composición del medio que se alimenta se diseña según que sustrato es el limitante reservorio bomba Fo BIOREACTOR rebalse medio fresco Cio Ci Fo, Ci

Cultivo continuo X transitorio estacionario s inicio alimentación

Cultivo continuo en e.e

Cultivo continuo Balance de biomasa Balance de sustrato Balance de producto

Cultivo continuo Balance de sustrato con mantenimiento (rp = 0)

Cultivo continuo µmax = 1.0 h-1 Y´x/s = 0,5 gX /gS ms = 0,05 gS/gX h Ks = 5 mg/l S0 = 2,0 g/l

Aplicaciones del cultivo continuo Estudios fisiológicos. Se puede discriminar el efecto de la velocidad de crecimiento y de las condiciones de cultivo en la fisiología celular. Varío la composición del medio y parámetros del cultivo a µ =cte Varío µ manteniendo cte el resto de los parámetros Muestreo estadístico en el estado estacionario Inconvenientes del sistema continuo Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de plásmidos Contaminación Imposibilidad de establecer estado estacionario

Cultivo batch alimentado (B.A) Es un cultivo que se alimenta con medio fresco. El volumen varía con el tiempo pues no se retira cultivo. Dos tipos de B.A Controlado por alimentación: el cultivo sigue el curso que le dicta la alimentación Con alimentación controlada: el estado del cultivo ( captado por sensores ) controla la alimentación reservorio bomba F(t) BIOREACTOR C(t) V(t) Vo Vf Vr = Vf - Vo

Cultivo B. A Balance de biomasa Balance de producto Balance de sustrato

Cultivo B. A

Cultivo B. A

El objetivo del BA es básicamente controlar el µ Cultivo B. A El objetivo del BA es básicamente controlar el µ Limitar la demanda de O2 del cultivo Obtener altas concentraciones de X evitando el efecto osmótico y tóxico de nutrientes Incrementar el qp (metabolitos secundarios, proteínas recombinantes) para maximizar el Yp/s. Maximizar el crecimiento celular (efecto Crabtree en levaduras)