UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO TÉCNICAS EN INMUNOLOGIA I MARIA JOSE JARAMILLO ESTRELLA 8 DE SEPTIEMBRE DEL 2011

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE La cuantificación de los subgrupos de células utiliza 3 factores: Existencia de una molécula en la superficie celular específica de subgrupo (p.ej. , CD4 para los linfocitos T) Un anticuerpo monoclonal específico de la molécula Sustancias químicas llamadas fluorocromos que producen fluorescencia a una longitud de onda concreta cuando se exponen a una fuente de luz excitadora: fluoresceína (verde), ficoeritrina (naranja) y aloficocianina (rojo)

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE Citometría de Flujo

DETERMINACION DE LINFOCITOS T EN MUESTRAS DE SANGRE

ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: SEPARACION Y ANALISIS DE LOS LINFOCITOS PARA LAS RESPUESTAS PROLIFERATIVAS Separación de los leucocitos de la sangre utilizando gradiente de densidad. La purificación puede obtenerse utilizando anticuerpos monoclonales específicos marcados con bolas magnéticas

ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: SEPARACION Y ANALISIS DE LOS LINFOCITOS PARA LAS RESPUESTAS PROLIFERATIVAS Análisis de la proliferación para determinar la respuesta del linfocito T al antígeno específico

ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: ESTIMULOS POLICLONALES METODOS DE ACTIVACION ACTIVADOR POLICLONAL O MITÓGENO LA LECTINA FITOHEMAGLUTININA (PHA) ENLACES CRUZADOS CON GLUCOPROTEINAS DE SUPERFICIE DE LINFOCITOS T. ANTI-CD3 MONOCLONAL ENLACES CRUZADOS CON EL COMPLEJO TCR SUPERANTÍGENOS ENTEROTOXINA B ESTAFILOCÓCICA SUSTANCIAS MICROBIANAS SE UNEN A LOS DOMINIOS DE LAS CADENAS Vβ DEL TCR (INVESTIGACIÓN Y EXPLORACION DIAGNOSTICA EN PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIAS) ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y MEDIR SU RESPUESTA ACTIVACION Y PROLOFERACION DE TODOS LOS LINFOCITOS T FRENTE A ESTIMULOS ESPECIFICOS PROLIFERACION DE LINFOCITOS T Y PRODUCCION DE CITOCINAS EFECTORAS

Las citocinas que se producen pueden determinarse: ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: CITOCINAS Y TETRÁMEROS La determinación de la respuesta del linfocito T se lleva a cabo de diferentes modos, uno de los más sencillos es la citometría de flujo pero con frecuencia se requiere de información mas detallada sobre las citocinas, lo que permite clasificar las respuestas como TH1, TH2, TH17 o Treg. Las citocinas que se producen pueden determinarse: ELISA: inmunoanálisis enzimático sobre fase sólida Citometría de Flujo: para determinarlos dentro de la célula PCR (reacción en cadena de la polimerasa: para los transcritos de ARNm específicos de las citocinas.. ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles

(respuestas antivíricas) ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: CITOCINAS Y TETRÁMEROS ADN recombinante para sintetizar molécula del HLA solubles. Las moléculas de HLA se ensamblan en los complejos de 4 componentes péptido-HLA (tetrámero de HLA) lo que aumenta la avidez de interacción . El tetrámero se acopla a un fluorocromo de modo que los linfocitos T individuales son capaces de unirse al epítopo específico. Revolucionado la capacidad de determinar respuestas inmunitarias por ejemplo: al virus de Epstein-Barr (respuestas antivíricas)

ACTIVACION DE LOS LINFOCITOS T Y DETERMINACION DE LAS RESPUESTAS EN EL LABORATORIO: ANALISIS DE CITOTOXICIDAD Examinar la lisis específica por los CTL y la destrucción de los linfocitos asesinos naturales. El análisis se basa en la incubación de las células efectoras y las células diana y la determinación de afección de éstas. En la evaluación de la actividad de CTL debe usarse la célula diana emparejada con la molécula del MCH apropiado. Las células diana se marcan mediante incubación con cromato sódico radiactivo. Si las células diana son dañadas por los efectores se libera el cromo del citoplasma. Los niveles de radiactividad son proporcionales a la lisis de la célula diana.

TOLERANCIA INMUNOLÓGICA Burnet y Medewar, galardonados con el premio Nobel de Medicina en 1960, estudiaron el rechazo de injertos cutáneos alogénicos (no propios), en los que observaron una asociación linfocítica masiva. La importancia radica en que se puede obtener tolerancia a antígenos extraños, aunque la vía de inyección neonatal no se use en el transplante de órganos.

MEDICION ENSAYO EJEMPLOS ESPECIFICOS Concentración de Ig Nefelometría IgG, IgM, IgA e IgE Gammapatías monoclonales Inmunoelectroforesis, inmunofijación Componente M Complemento: Componentes individuales Actividad hemolítica total ELISA Prueba de fijación de complemento C1, C2, C3, C4 CH50 Anticuerpos de agentes infecciosos: VIH Streptococo Treponema pallidum ELISA, western blot Aglutinación Anti-gp24, gp41, gp120 Polisacarido anticapsular VDRL Autoinmunidad: Anticuerpos anti-Ig Hemaglutinacion pasiva Factor reumatoide Anticuerpos antinucleares Inmunofluorescencia ANA, y anti DNA`s Marcadores de superficie celular Linfocitos normales Tumores celulares Citometría de flujo CD4, CD8, CD19 CD10 o células leucémicas