infecciones parasitarias Inmunidad innata en infecciones parasitarias Alvaro Díaz Cátedra de Inmunología Facultad de Química/DepBio y Facultad de Ciencias/IQB

El sistema inmune innato constituye los “cimientos” del sistema inmune RESPUESTAS ADAPTATIVAS potenciación instrucción RESPUESTAS INNATAS INDUCIDAS DEFENSAS INNATAS CONST. RECONOCIMIENTO INNATO PRRs MECANISMOS EFECTORES PAMPs PATÓGENOS

Los PRRs canónicos: los TLR (con sus proteínas adaptadoras) : Dominio TIR Los dominios TIR reclutan proteínas adaptadoras que también poseen dominios TIR altamente conservados: MyD88, utilizada por todos los TLR menos TLR3 MAL (MyD88-adaptor-like) que se une a TLR4 y 2 y actúa de puente para reclutar Myd88 en estos receptores TRIF (Tir-domain containing adaptor protein inducing IFNb)- responsable de iniciar la cascada de señalización independiente de Myd88 en TLR4 y única proteína adaptadora del TLR3 TRAM (TRIF related adaptor molecule) importante para el TLR y el inicio de la cascada indep de MyD88 SARM (sterile alfa and armadillo motif containing protein) que interacciona con TRIF y actúa como inhibidor de la cascada de reacciones que desde allí se desencadenan. El uso de adaptadoras varía con el TLR y esto es importantes porque se acoplan diferentes cascadas de proteínas quinasas que finalmente llevan a la activación de factores de transcripción como NFkB y diferentes IRFs. Todos los TLR activan NFkB, ya sea mediante la vía dependiente de myd88 o la dependiente de TRIF o ambas en el caso del TLR4, con la activación subsiguiente de genes de citoquinas y quemoquinas pro-inflamatorias, y diversas moléculas de superficie como MHCII y moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86 en células presentadoras de antígeno. Otros TLR activan diferencialmente a IRF3 (dependiente de TRIF en TLR3 y 4) o IRF7 (dependiente de MyD88 en TLR7 y 9) para estimular la expresión de IFN de tipo I. 3

Los perfiles de respuesta adaptativa Respuestas de tipo 1 Macrófagos clásicamente activados DC1s Células Th1 IFN-g Respuestas de tipo 2 Macrófagos alternativamente activados DC2s Eosinófilos, mastocitos, basófilos Células Th2 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 (IL-10) IgE La decisión entre estos perfiles está determinada desde el sistema inmune innato

Las señales de “instrucción” y de “potenciación” no son todas iguales RESPUESTAS ADAPTATIVAS potenciación instrucción RESPUESTAS INNATAS INDUCIDAS DEFENSAS INNATAS CONST. RECONOCIMIENTO INNATO PRRs MECANISMOS EFECTORES PAMPs PATÓGENOS

¿Cómo “ve” el sistema inmune innato a los parásitos? Esta clase… ¿Cómo “ve” el sistema inmune innato a los parásitos? ¿Qué PAMPs? ¿Qué PRRs? ¿Qué respuestas? ¿Existen PRR/PAMPs/respuestas comunes a los parásitos?? ¿O al menos comunes a los protozoarios, o a los helmintos??

Tipos de respuestas (incluyendo adaptativas) Preguntas difíciles… Puede ser mejor encararlas “ de arriba hacia abajo”: Tipos de respuestas (incluyendo adaptativas) Tipos de señales instructivas desde la inmunidad innata PRRs y PAMPs

Antes de entrar de lleno en las preguntas… ¿Qué tienen en común los “parásitos”..?

Veámoslos en el árbol de la vida nosotros nosotros

Establecen infecciones crónicas, evadiendo la inmunidad… Son todos eucariotas…. (pero también lo son los hongos, y los artrópodos ectoparásitos…) Establecen infecciones crónicas, evadiendo la inmunidad… (cosa que también hacen ciertas bacterias y hongos) Son todos parásitos obligados (en contraste con los patógenos fúngicos)

Empecemos por los protozoarios… Se replican por mitosis… si no se les controla, terminan con el hospedero Han sin duda dejado una huella evolutiva importante sobre el sistema inmune

Tienen estadíos intracelulares, incluyendo intra-macrófago Su control necesita de la activación (clásica) de macrófagos

Las respuestas contra protozoarios suelen ser de tipo 1 Inmunización y reestimulación de esplenocitos in vitro de Jankovic et al., Immunity 16:429 (2002)

Y la protección contra infecciones por protozoarios depende de las respuestas de tipo 1 Infección por T. gondii en ratones de Jankovic et al., Immunity 16:429 (2002)

Se conocen PAMPs de protozoarios Dan señales a través de TLRs e inducen respuestas de tipo 1 Anclas glicofosfaditil inositol de Trypanosoma, Leishmania, (Toxoplasma, Plasmodium) TLR2 Ceramidas con glicoinositol fosfolípido de Trypanosoma TLR4 Proteína Tc52 de Trypanosoma cruzi TLR2 Profilina de Toxoplasma y otros apicomplexa TLR11 Peroxiredoxina de Plasmodium TLR4 HSP70 de Toxoplasma TLR4 …………..

Como esperaríamos, el adaptador de TLRs más importante, MyD88, es esencial para la respuesta de tipo 1 y para la protección Infección por T. gondii en ratones De Scanga et al (2002) J Immunol 168:5997

Y las respuestas Th17………… Highly inflammatory macrophage phenotyhpes? neutrophils IL-17, IL-17F, TNFa, IL-21 IL-23 IL-23R RORgt Th17 IL-6 + TGFb Thp

La respuesta Th17 es necesaria para protección frente a Toxoplasma gondii en ratones De Kelly et al (2005) Infect Immun 73: 617

Pero por supuesto los protozoarios logran establecer infecciones crónicas…

La infección crónica por Leishmania es hecha posible por células T reguladoras (CD4+/CD25+) secretoras de IL-10 Ratones RAG-/- transplantados con células T y desafiados con el parásito. Cargas parasitarias a las 3.5 y 17 semanas De Belkaid et al., Nature 420:502 (2002)

(sigue sin estar claro si estas Treg son naturales o inducidas) Las células T reguladoras expandidas en los sitios de infección por Leishmania son específicas para el parásito Proliferación ex vivo de células T, por CFSE (sigue sin estar claro si estas Treg son naturales o inducidas) De Suffia et al., (2006) J Exp Med 203: 777

También hay regulación por IL-10 producidas por las propias células T efectoras (Leishmania) Y de regulación por células T reguladoras FoxP3- (inducidas) (malaria) En suma: El reconocimiento de los protozoarios por TLR induce respuestas Th1 (y algo de Th17) Pero estos parásitos consiguen superponerles diferentes respuestas reguladoras

Deberíamos comenzar a preguntarnos cuáles son los determinantes innatos de las respuestas T reguladoras (y también de las respuestas Th17…) .. 4 colores…

Y ahora seguimos con los helmintos … En general no se replican dentro de cada hospedero individual En general causan morbilidad más que mortalidad (otro hospedero)

Los estadíos infectantes de los helmintos causan al menos cierta respuesta inflamatoria En cambio, los estadíos establecidos en general controlan la inflamación Inflamación temprana: ¿mecanismos de reconocimiento? Activación de complemento ¿TLRs..?

Las respuestas contra helmintos son de tipo 2 Inmunización y reestimulación de esplenocitos in vitro de Jankovic et al., Immunity 16:429 (2002)

El asunto está en cómo las definimos Ha habido sus dudas sobre la capacidad protectora de las respuestas de tipo 2… El asunto está en cómo las definimos

Las respuestas de “tipo 2 modificadas” IL-4 IL-10 TGF-b IL-5, IL-13 Control de la inflamación Inmunosupresión específica filariasis De Maizels et al., Immunol Rev 201:89 (2004)

Las células y moléculas responsables de la respuesta tipo 2 modificada Células T reguladoras IL-10 TGF-b CTLA-4 ¿Células mieloides supresoras? ¿Células B-1…? ¿Otras ….?

Tipo 2 modificado no es lo mismo que tipo 2 Sensibilización con OVA o Derp-1, seguida de desafío intratraqueal con alergeno, en ratones control e infectados con H. polygirus De Wilson et al., J. Exp. Med. 202:1199 (2005)

Tipo 2 modificado no es lo mismo que tipo 2 (cont.) Citoquinas en lavado broncoalveolar De Wilson et al., J. Exp. Med. 202:1199 (2005)

La hipótesis de la higiene original (o un espacio monodimensional) Infecciones (bacterianas) alergias Tipo 2 Tipo 1

La infección por S. haematobium se correlaciona inversamente con la alergia De van der Biggelaar et al., Lancet 356:1723 (2000)

La hipótesis de la higiene modificada (o un espacio bidimensional) Infecciones por helmintos Tipo 1 Tipo 2 Inflamatorio Regulatorio Autoinmunidad Infecciones bacterianas agudas Alergias Infecciones crónicas por protozoarios y micobacterias Fibrosis .

Thp Th17 Th1 Th2 iTreg Tr1 nTreg IL-6 + TGFb RORgt neutrophils IL-23R IL-23 RORgt IL-17, IL-17F, TNFa, IL-21 neutrophils highly inflammatory macrophage phenotypes? IFNg Th1 IL-12R IL-12 T-bet Hlx LTa classically activated macrophages IL-4 Th2 IL-4R GATA-3 C-Maf IL-5 IL-9 IL-13 IL-21 IL-25 alternatively activated macrophages eosinophils IL-10 TGF-b Retinoic acid Foxp3 iTreg Tr1 nTreg (expansion) Other mechanisms “deactivated”/ ”suppressor” macrophages? Suppression of the other 3 response arms

Las células T reguladoras permiten la infección crónica por un helminto Infección por L. sigmodontis Cargas parasitarias No alcanza con el tratamiento contra cd25 (que recordemos que no elimina las t reg, sino solo parcial y temporalmente). Si se ve un efecto si al mismo tiempo se incluye bloqueo de ctla-4 o ac estimulante por gitr. Creen que el efecto de anti-gitr o anti-ctla-4 es un efecto sobre las no-t reg, y que se precisa este junto con la deplecion de las t reg para ver algo. El tratamiento anti-cd25 solo o con junto anti-ctla-4 no restaura la responsividad de las t. la estimulación por gitr junto con anti-cd25 si restaura la respuesta. La depleción de células Treg CD25+ favorece la eliminación del parásito, pero sólo junto con bloqueo de CTLA-4 o estimulación por GITR De Taylor et al. 2005 J. Immunol. 174:4924 2007 J. Immunol. 179:4626

Parecería que: Las respuestas de tipo 2 evolucionaron para controlar a los helmintos La capacidad de protección de las respuestas de tipo 2 suele estar escondida debajo de las fuertes respuestas reguladoras que inducen los gusanos Los helmintos han evolucionado en forma convergente a inducir respuestas reguladoras sobre el “fondo” de tipo 2 Las respuestas reguladoras no se han seleccionado negativamente en los hospederos vertebrados debido a que son necesarias para las funciones “no inflamatorias” del sistema inmune

¿Cuáles son los PAMPs/PRR que determinan las respuestas de tipo 2? ¿Y las respuestas de tipo 2 modificadas?

Los alergenos con actividad proteolítica inducen respuestas de tipo 2 a través de los basófilos Basófilos en nódulo linfoide luego de inoculación de papaína Respuesta Th2 a papaína (como células que activan el gen de IL-4) en combinación con depleción de basófilos (Ac MAR-1) Los basófilos producen IL-4 y TSLP en respuesta a papaína, que condicionan a las DC y/o a los linfocitos T De Sokol et al 2008 Nat Immunol 9:310

Y algunas actividades proteolíticas de helmintos también son señales de tipo 2 Inmunización con extractos de B. pertussis (inductor de tipo 1) y de F. hepatica. IFN-g secretador por esplenocitos reestimulados con B. pertussis De O’Neil et al., Parasite Immunol 23:541 (2001)

¿Qué relación hay entre los TLRs y la instrucción de respuestas de tipo 2, y de tipo 2 modificadas?

Dominio TIR Los dominios TIR reclutan proteínas adaptadoras que también poseen dominios TIR altamente conservados: MyD88, utilizada por todos los TLR menos TLR3 MAL (MyD88-adaptor-like) que se une a TLR4 y 2 y actúa de puente para reclutar Myd88 en estos receptores TRIF (Tir-domain containing adaptor protein inducing IFNb)- responsable de iniciar la cascada de señalización independiente de Myd88 en TLR4 y única proteína adaptadora del TLR3 TRAM (TRIF related adaptor molecule) importante para el TLR y el inicio de la cascada indep de MyD88 SARM (sterile alfa and armadillo motif containing protein) que interacciona con TRIF y actúa como inhibidor de la cascada de reacciones que desde allí se desencadenan. El uso de adaptadoras varía con el TLR y esto es importantes porque se acoplan diferentes cascadas de proteínas quinasas que finalmente llevan a la activación de factores de transcripción como NFkB y diferentes IRFs. Todos los TLR activan NFkB, ya sea mediante la vía dependiente de myd88 o la dependiente de TRIF o ambas en el caso del TLR4, con la activación subsiguiente de genes de citoquinas y quemoquinas pro-inflamatorias, y diversas moléculas de superficie como MHCII y moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86 en células presentadoras de antígeno. Otros TLR activan diferencialmente a IRF3 (dependiente de TRIF en TLR3 y 4) o IRF7 (dependiente de MyD88 en TLR7 y 9) para estimular la expresión de IFN de tipo I. 42

La hipótesis de la inducción de Th2 “por defecto”: Los KO en MyD88 siempre están sesgados hacia Th2 MyD88-/- WT MyD88-/- WT Inmunización con OVA en adyuvante completo de Freund Citoquinas de células de ganglio reestimuladas con OVA Inmunización con OVA en adyuvante completo de Freund IgE antes y después de la inmunización De Schnare et al., Nature Immunol. 2:947 (2001)

Sin embargo, tiene que haber señales positivas para la respuesta Th2 De Cervi et al., J. Immunol. 172:2016 (2004)

Un producto de filarias puede inhibir las respuestas de tipo 1 en forma dependiente de TLR4 Proteína (“ES-62”) con glicanos terminados en fosforilcolina Macrófagos de médula ósea pretratados con IFN-g induce IL-10 de células B-1 hace madurar las DCs a DC2 De Goodridge et al., J. Immunol. 174:284 (2005)

Células HEK 293 transfectadas con TLRs y sistema reportero Un lípido de Schistosoma, agonista de TLR2, induce respuestas reguladoras Células HEK 293 transfectadas con TLRs y sistema reportero Lisofosfatidilserina DCs humanas maduradas en presencia y ausencia de lípido de Schistosoma, y co-cultivadas con céulas T, luego reestimuladas De van der Kleij et al., J. Biol. Chem. 277:48122 (2002)

Los ratones TLR2 KO infectados con S Los ratones TLR2 KO infectados con S. mansoni tienen respuestas reguladoras impedidas IFN-g WT TLR2 KO IL-13 Células T de ratones infectados, estimuladas in vitro con células presentadoras normales y SEA IL-10 Granuloma “normal” Granuloma exacerbado De Layland et al, EJI 37:2174

En cambio: Los ratones MyD88 KO infectados con S. mansoni tienen respuestas más sesgadas a tipo 2 (como se esperaría) IFN-g IL-4 WT MyD88 KO IL-10 Granuloma “normal” Granuloma algo más pequeño Células de bazo de ratones infectados, estimuladas in vitro con SEA De Layland et al, EJI 35:3248

TLR2 KO MyD88 KO Tipo 1 Tipo 2 Inflamatorio Regulatorio Autoinmunidad Infecciones por helmintos Tipo 1 Tipo 2 Inflamatorio Regulatorio Autoinmunidad Infecciones bacterianas agudas Alergias Infecciones crónicas por protozoarios y micobacterias Fibrosis TLR2 KO . MyD88 KO

¿Pero cómo???? Por lo tanto: Señalización por TLR2 ≠ señalización por MyD88 global MyD88 induce siempre respuestas tipo 1 Los TLR inducen respuestas tipo 1 pero (alguno de ellos) también podría inducir, de forma independiente de MyD88, respuestas reguladoras (y quizás tipo 2) … ¿Pero cómo????

¿Vías de señalización de los TLRs aún no conocidas? Dominio TIR ? ? Los dominios TIR reclutan proteínas adaptadoras que también poseen dominios TIR altamente conservados: MyD88, utilizada por todos los TLR menos TLR3 MAL (MyD88-adaptor-like) que se une a TLR4 y 2 y actúa de puente para reclutar Myd88 en estos receptores TRIF (Tir-domain containing adaptor protein inducing IFNb)- responsable de iniciar la cascada de señalización independiente de Myd88 en TLR4 y única proteína adaptadora del TLR3 TRAM (TRIF related adaptor molecule) importante para el TLR y el inicio de la cascada indep de MyD88 SARM (sterile alfa and armadillo motif containing protein) que interacciona con TRIF y actúa como inhibidor de la cascada de reacciones que desde allí se desencadenan. El uso de adaptadoras varía con el TLR y esto es importantes porque se acoplan diferentes cascadas de proteínas quinasas que finalmente llevan a la activación de factores de transcripción como NFkB y diferentes IRFs. Todos los TLR activan NFkB, ya sea mediante la vía dependiente de myd88 o la dependiente de TRIF o ambas en el caso del TLR4, con la activación subsiguiente de genes de citoquinas y quemoquinas pro-inflamatorias, y diversas moléculas de superficie como MHCII y moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86 en células presentadoras de antígeno. Otros TLR activan diferencialmente a IRF3 (dependiente de TRIF en TLR3 y 4) o IRF7 (dependiente de MyD88 en TLR7 y 9) para estimular la expresión de IFN de tipo I. 51

¿Señalización combinatoria con otros PRRs? Flagelina TLR5

Sí ¿Hay PRR no TLR que participen en el reconocimiento de los helmintos? Sí

La modulación de DC (en contra de la respuesta tipo 1) por antígeno soluble de huevo de Schistosoma (SEA) es independiente de MyD88 (y de TLR2, TLR4) WT MyD88 KO Respuestas in vitro de DC WT y MyD88 KO estimuladas con SEA y/o LPS (el LPS tiene efectos independientes de MyD88) De Kane et al IAI 2008 (en impresión)

Y la inducción de respuesta Th2 in vivo por SEA es independiente de TLR2 y TLR4 Inmunización con DC pulsadas con SEA. Respuestas ex-vivo de esplenocitos reestimulados con SEA De Kane et al IAI 2008 (en impresión)

Varios receptores lectina tipo C interaccionan con SEA De: van Liempt et al 2007, Mol Immunol 44:2605

No se conocen los receptores La quitina induce respuestas asociadas con Th2 en forma independiente de TLR4 y MyD88 Eosinófilos en pulmón luego de quitina i.n. No se conocen los receptores De Reese et al., Nature 2007 447:92 (También hay respuestas Th17 por fragmentos de quitina, que dependen de TLR2 y MyD88) Da Silva et al., 2008 JI 181:4279

Entonces: - Las señales iniciales para Th2 son muy variadas: proteasas, glúcidos presentes en SEA, quitina …. Quizás los TLR tienen menos importancia para la Th2 que para la Th1 (y MyD88 señaliza siempre en contra de la Th2) Probablemente sean centrales en inducción de Th2 receptores no TLR, incluyendo lectinas tipo C, receptores activados por proteasas, y receptores (por ahora desconocidos) para quitina. - TLR2, seguramente en combinación con receptores no TLR adecuados, puede señalizar para respuestas reguladoras. Y debe haber varios otros PRRs que induzcan respuestas reguladoras.

RESPUESTA TIPO 2 MODIFICADA La idea del “embudo”: HABRÍA MUCHOS, DIFERENTES, PAMPs DE HELMINTOS QUE SE UNIRÍAN A UN CONJUNTO LIMITADO DE RECEPTORES ¿TLRs, CLRs, PARs,...? EXPRESADOS EN VARIOS TIPOS CELULARES + ¿Eos, MC, PMN, ...? DC Mac B Basófilos E INDUCIRÍAN UN TIPO RESPUESTA RESPUESTA TIPO 2 MODIFICADA

Entonces: ¿Cómo “ve” el sistema inmune los parásitos? ¿Qué PAMPs? ¿Qué PRRs? ¿Qué respuestas? ¿Hay PRR/PAMPs/respuestas comunes a los parásitos? ¿O al menos comunes a los protozoarios, y por otro lado, comunes a los gusanos?

Las respuestas: Comunes a todos los parásitos: Respuestas reguladoras/anti-inflamatorias (en común con los demás patógenos que establecen infecciones crónicas) Comunes a los protozoarios: Respuestas de tipo 1, modificadas por respuestas reguladoras Comunes a los helmintos: Respuestas de tipo 2, modificadas por respuestas reguladoras

Probablemente lectinas tipo C y receptores activados por proteasas Los PRRs Comunes a todos los parásitos: Puede ser que los TLRs respondan a PAMPs de todos los tipos de parásitos, así como de los patógenos bacterianos, fúngicos y virales Es probable que los PRRs que instruyen respuestas reguladoras tengan ligandos en todos los patógenos que dan infecciones crónicas Comunes a los helmintos: Podría haber PRRs que instruyan respuestas de tipo 2... Probablemente lectinas tipo C y receptores activados por proteasas (pero estos PRR también responden a hongos y a otros patógenos)

Los PAMPs Probablemente sean extremadamente variados, y compartidos sólo entre grupos cercanos de parásitos. El reconocimiento de PAMPs variados quizás sea canalizado “en forma de embudo” a través de un número limitado de PRRs

Los perfiles de respuesta siguen líneas funcionales, y no filogenéticas Tipo 1 Tipo 2

La capacidad de inducir respuestas reguladoras seguramente surgió varias veces en la evolución Tipo 1 Tipo 2 Inflamatorio/Th17 Regulatorio

FIN PENSAR QUE SOY “TIPO 2”…