Onda electromagnética = cambios periódicos de un campo magnético (M) y un campo eléctrico (E) en el espacio y en el tiempo, que se propagan a la velocidad de la luz. En cualquier punto, M es perpendicular a E, ambos oscilan en planos perpendiculares a la dirección de propagación. Onda EM polarizada en un plano (vertical) se representa sólo el vector E (en verde) Onda EM polarizada en un plano (horizontal) se representa sólo el vector E (en rojo) Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism

2 ondas polarizadas en un plano, en fase (alcanzan picos y cero al mismo tiempo) Vector resultante = luz polarizada en un plano pero a 45º respecto a los componentes iniciales Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism

Propagación de la onda resultante en espiral (no sinusoidal) 2 ondas polarizadas en un plano pero desfasadas 90º (o -90º) o sea una alcanza maximos (o mínimos) cuando la otra pasa por cero Vector resultante rota en un círculo = luz polarizada circularmente a derecha a izquierda Propagación de la onda resultante en espiral (no sinusoidal) Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism

Interacción de luz polarizada con la materia Luz polarizada en un plano, al interaccionar con medio que absorbe (no birrefringente) Luz trasmitida polarizada en igual plano, pero de menor intensidad (menor amplitud, igual frecuencia)

Luz polarizada circularmente al interaccionar con medio que absorbe (no birrefringente) Luz trasmitida polarizada también circularmente, pero de menor intensidad (menor amplitud, igual frecuencia)

Vector resultante = luz polarizada en un plano 2 ondas polarizadas circularmente a derecha e izquierda, de la misma amplitud Vector resultante = luz polarizada en un plano Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism

Luz trasmitida polarizada elípticamente Luz polarizada circularmente al interaccionar con medio que absorbe diferencialmente a izquierda y derecha No absorbe luz polarizada circularmente a izquierda (rojo) Absorbe luz polarizada circularmente a derecha (verde) Luz trasmitida polarizada elípticamente CD transforma luz incidente polarizada en un plano en luz polarizada elípticamente

θ = elipticidad (medida en grados, “deg”) DICROISMO CIRCULAR Mide la capacidad de moléculas ópticamente activas de absorber diferencialmente la luz polarizada circularmente a izquierda y a derecha A = absorbancia a determinada l ε= coef. Absortividad molar (M-1 cm-1) C = conc. (en M) de la muestra l = paso optico                      θ = elipticidad (medida en grados, “deg”) [θ] = elipticidad molar (deg cm2 dmol-1)

θ (deg) = 33 DA [θ] = θ x 100 x MW c ( mg/mL) x l (cm) Como la elipticidad es un valor pequeño en general, tan θ = θ (radianes) Como la intensidad de la radicación I es proporcional a E2 Como ΔA<<1, se puede aproximar usando serie de Taylor y convirtiendo radianes a grados: θ (deg) = 33 DA [θ] = θ x 100 x MW c ( mg/mL) x l (cm) [θ] (deg cm2 dmol-1) = 3300 Dε

θ(deg) x 100/ l C = 3300 Dε = [θ] molar (deg cm2 dmol-1) θ (deg) = 33 DA θ(deg) x 100/ l C = 3300 Dε = [θ] molar (deg cm2 dmol-1) Para una medida θ = 10 mdeg, DA = 0.0003 !!! buena estabilidad del espectropolarímetro cuvetas de cuarzo fundido alta transparencia temperatura controlada en UV lejano molestan algunas sales de buffers, O2 (degasear)

Espectros CD de proteínas • Región UV lejano, región amida: 170 - 250 nm Dominada por contribución del enlace peptídico. Da información sobre estructura secundaria. Absorción característica: α-hélice (2 mínimos a 208 y 222 nm y máximo a 190 nm) β plegada (1 mínimo a 217 nm y 1 máximo a 195 nm) Información muy confiable para proteínas con fuerte % α-hélice, comparable a Dif RX o RMN • Región UV cercano: 250 – 300 nm Contribución de aminoácidos aromáticos y disulfuros Da información sobre estructura terciaria Criterio muy sensible del estado nativo de la proteína

CD lejano CD cercano Proteína recombinante vs proteína natural = proteína (anticuerpo monoclonal) de 2 distintos lotes de producción

Variación de la elipticidad (θ a 220 nm) con la temperatura. La misma concentración de proteína pero en buffers a distintos pH: línea azul pH 6.0, línea verde 7.4, línea celeste pH 8.5

Dicroismo circular UV lejano de proteínas Cálculo de cantidad relativa de estructura secundaria θi (λ) = Espectro CD base para cada estructura secundaria i (polipéptidos sintéticos o proteínas modelo) [θ(λ)] = fα [θα (λ)] + f β [θβ (λ)] + f t [θt (λ)] + fR [θR (λ)] α = α-hélice β = β plegada t = giros (turn) R = ovillo estadístico (Random coil) Σf i = 1 f i se obtiene resolviendo para un set de λ

Aplicaciones CD-UV de proteínas: Estimar % de estructura secundaria (fracción de la proteína como a-hélice, b plegada, giro b u otra) Cambios en estructura secundaria (con temperatura, agentes desnaturalizantes) Verificar si la proteína está en su conformación nativa (efecto del pH, sales, solventes, temp.) CD-Visible de proteínas con grupos prostéticos (cuando el metal se encuentra en ambiente quiral) Información sobre la interacción metal-proteína. Resuelve bien transiciones electrones d-d

CD de ácidos nucleicos nativo Espectro CD (arriba) y de absorción (abajo) de ADN de E.coli nativo (―), desnaturalizado (– – –) y la suma de los deoxinucléotidos correspondientes (•••) desnaturalizado

CD de ácidos nucleicos Representación esquemática de los espectros CD-UV de ADN en varias estructuras secundarias: A, B y C (o Z)

CD de ácidos nucleicos CD-UV espectro Polideoxinucléotido GC: poli d(GC).poli d(GC) en distintas estructuras secundarias: B-ADN (•••), A-ADN (– – –) y Z-ADN (―) A B Z

2[qApG(l)] = [qA(l)] + [qG(l)] + IAG(l) El espectro CD de ApG, es la suma de los monómeros + término adicional que considera la interacción base-base: 2[qApG(l)] = [qA(l)] + [qG(l)] + IAG(l) El espectro CD de ApGpU, es la suma de los monómeros + términos adicionales que consideran cada interacción base-base: 3[qApGpU(l)] = [qA(l)] + [qG(l)] + [qU(l)] + I'AG(l) + I'GU(l) + I”AU(l)

Aplicaciones CD-UV de ácidos nucleicos: Verificar correcto apareamiento de bases (por ej. de una hebra modificada con su hebra complementaria) Cambios en estructura secundaria con temperatura, agentes desnaturalizantes (por ej. cálculo de Tm) Estudiar isomerizaciones conformacionales (helix-coil, B-A, B-Z)