Ph.Dc Franklin Pérez Yordan Vivanco Muñoz IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Litopenaeus vannamei UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES TIPO MICROSATÉLITES Ph.Dc Franklin Pérez Yordan Vivanco Muñoz

Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32 familias de camarón Análisis financiero de la utilización de la técnica de microsatélites para un sistema de producción comercial

IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32 familias de camarón

INTRODUCCIÓN

ACTUALES PROBLEMAS BIOLÓGICOS EN LA PRODUCCIÓN DE CAMARÓN Enfermedades - Síndrome de Las Gaviotas (1990) - Síndrome de Taura (1994) - Síndrome de la Mancha Blanca (1999) Bajo crecimiento Endogamia

MEJORAMIENTO GENÉTICO Cruzando individuos de diferente procedencia con mejores resultados en el campo se puede obtener variedades más resistentes y con mejor crecimiento Implementación el uso de marcadores moleculares (o genéticos) para programas de mejoramiento genético

VENTAJAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES Identifican el grado de parentesco entre individuos, evitando el cruce entre hermanos (endogamia) Su relativa fácil aplicación permite incluir programas de mejoramiento genético en programas de producción

MARCADOR MOLECULAR Es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear.

TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES Marcador Dominante Marcador Codominante (Microsatélites)

….AGGCACTCACACACACACACACACACACACCTTATA…. MICROSATÉLITES Son secuencias de bases repetitivas ej: ….TCCGTGAGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGGAATAT.... ….AGGCACTCACACACACACACACACACACACCTTATA…. Abundantes en el genoma Presentan alta variabilidad Repeticiones van de 2 a 6 pares de bases con longitudes de 20 a 100 pb Pueden estar relacionadas con genes importantes (de resistencia y crecimiento)

VISUALIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES

AISLAMIENTO Y AMPLIFICACIÓN POR PCR DE UN FRAGMENTO DESEADO DE DNA CICLO 1 CICLO 2 3’ 5’ CICLO 4 3’ 5’ 3' CICLO 3

MATERIALES Y MÉTODOS

OBTENCIÓN DE PRIMERS Se diseñó a partir de secuencias publicadas en NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) con el programa Genfisher 1ra amplificación: extracción CTAB (DNA purificado) T°: 42 – 45 – 48 – 51 – 54 – 57 – 60 [MgCl2]: 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5 2da amplificación: extracción CHELEX (DNA no purificado)

OBTENCIÓN DE MUESTRA 32 familias obtenidas por el programa de mejoramiento PROMOGEN. 15 animales por familia

OBTENCIÓN Y DOCUMENTACIÓN DE RESULTADOS PCR de las muestras Separación de bandas en gen de Poliacrialmida 6% Visualización por tinción de plata Cámara digital Kodak DC 120 Programa EDAS de Kodak El análisis del tamaño de las bandas corridas por electroforesis se llevó a cabo con el Programa GeneProfiler

CÁLCULO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA Análisis de heterocigocidad observada Análisis de heterocigocidad esperada

TIPO DE SEGREGACIÓN ESPERADA EN EL ANÁLISIS DE 2

ANÁLISIS ENTRE FAMILIAS Análisis de Lineaje de familias: Programa Kinship 1.2 Análisis Cluster (agrupamientos): Programa TFPGA que realiza dendogramas basados en el análisis UPGMA

RESULTADOS

MICROSATÉLITES ESCOGIDOS DE 131 PARES DE PRIMERS locus Secuencia de los primers T° (TD) [MgCl2] (Mm) Acceso al NCBI CN-54 F: TGCTTGTGAAGGTGTGTGAACGTG R: CAAGATGCGTATGCACACATTGCTG 43 1,0 AF360040 CN-67 F: GAAGAGGCAGGGCGGATTT R: GGAAGGGTGGGAACAAGG 51 2,0 AF360007 CN-84 F: GGGTTATGATGACCAAAG R: ATTGGGTCTCGGAGTTTA 59 AF360114 CN-135 F: ATAATGCGAGCGTGAG R: ATTCCTTAGCGAACCA AF359979 CN-142 F: TGCTACGCCGACAATG R: GAAGGTGCTTGCGACA AF360029 CN-148 F: CATCATCGCTAAAATT R: CCTTCTGTTGTGGGTAT AF360051 CN-159 F: AAGAACGAAGTGGAGGAG R: AAGCACCCAGTGTAGCC 47 AF360109

PRESENCIA DE ALELOS NULOS Familia 2 CN-67 CN-46 Familia 22 CN-67 CN-46

HETEROCIGOCIDAD

PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA 7 CASOS DE SEGREGACIÓN

PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA 7 CASOS DE SEGREGACIÓN

PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA Familia que no presenta ningún caso de segregación CN-84, familia 23

PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA Individuo que no presenta el perfil del grupo

AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP * Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos ** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos *** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanos

AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP * Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos ** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos *** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanos NS No significativo

AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP

AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP

AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP

DENDOGRAMA FAMILIAR REALIZADO CON EL PROGRAMA TFPGA

DISCUSIÓN

PRESENCIA DE ALELOS NULOS No hay correcto plegado de iniciador, por una mutación Modificación o cambio de primer podría amplificar el alelo nulo Puede subir la proporción de falsos homocigotos

VARIABILIDAD GENÉTICA Cuando la Ho es menor que la He se debe a una alta consanguinidad (muchos homocigotos) o incidencia de alelos nulos Caso los loci CN-84; CN-135; CN-142; CN-148; CN-159 Cuando la Ho es mayor que la He se debe a un exceso de heterocigotos por a las cruzas dirigidas y no al azar Caso del locus CN-54

VARIABILIDAD GENÉTICA La población silvestre ecuatoriana (Casalla, 2003) tiene más variabilidad que las familias en estudio por tener: Mayor número de alelos Mayor Heterocigocidad Presencia de 21 alelos en las familias que no tiene la población silvestre debido al origen distinto de algunos reproductores (Panamá)

SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO En la familia 25 encontramos: Locus Segregación CN-54 1* CN-67 1 CN-84 1:2:1 CN-135 CN-142 1:1:1:1 CN-148 CN-159 2da ley de Mendel: cada alelo tiene segregación independiente, no depende de la segregación de otro alelo.

SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO Se encotraron 2 grupos de familias, donde cada grupo presentó los mismos perfiles: F7 y F8 F16, F17 y F18 Hecho que supone la división de un desove en algunos tanques

SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO 20 individuos específicos (distribuidos en las familias) no pertenecieron al perfil familiar El individuo F5 12 no perteneció a los perfiles de la familia F5; pero fue agrupado (por el programa Kinship) en la familia 23 indicando el origen de la muestra

SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO Errores y discordancia en la segregación mendeliana se deben principalmente a 3 razones: Error durante la manipulación de la muestra Mal manejo de familias Por mutación (alelos nulos o alelos diferentes)

ANÁLISIS FINANCIERO Análisis financiero de la utilización de la técnica de microsatélites para un sistema de producción comercial

SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE SELECCIÓN FAMILIAR

SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE WALK BACK SELECTION

DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS A y B Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de 3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año Larvicultura: 2 Tanques de 13 m3 c/u; 6’200.000 larvas anual (3 ciclos) 1 Galpón para 50 recipientes de 50 L c/u 49 Tanques plásticos exteriores de 2 m3 Camaronera: 20 Has, 95.466 libras al año (3 ciclos) Están incluidos 1 Ha, selección de reproductores 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 9.900 reproductores al año

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO A Proyecto A: 5 años con ciclos de 4 meses

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO B Proyecto B: 5 años con ciclos de 4 meses

FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS A Y B

VENTAS DE LOS PROYECTOS A Y B

DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS C y D Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de 3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año Larvicultura: 2 Tanques 13 m3 c/u; 7’050.000 larvas anual (3 ciclos) Camaronera: 20 Has, 109.104 libras al año (3 ciclos) Incluiye: 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 7.200 reproductores al año

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO C Proyecto C: 5 años con ciclos de 4 meses

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO D Proyecto D: 5 años con ciclos de 4 meses

FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS C Y D

VENTAS DE LOS PROYECTOS C Y D

DISCUSIÓN: COMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS

CONCLUCIONES DE LA IDENTIFICACIÓN FAMILIAR CONCLUCIONES FINANCIERAS CONCLUSIONES CONCLUCIONES DE LA IDENTIFICACIÓN FAMILIAR CONCLUCIONES FINANCIERAS

CONCLUSION DE LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Se puede utilizar microsatélites específicos para Litopenaeus vannamei para la determinación de familias y parentesco Se comprobó la utilidad de la técnica de marcadores microsatélites para el control de programas de mejoramiento genético en camarón

RECOMENDACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Es preferible tener la información del genotipo de los padres, para conocer el genotipos de la descendencia y determinar si hubo mala manipulación al encontrar individuos introducidos. Un estudio con mayor número de loci microsatélites, los resultados son más exactos, debido a la presencia de alelos nulos

CONCLUSIONES DE LA COMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS Es mejor implementar el sistema de Walk Back Selection por su menor necesidad de inversión y tener los mejores índices, la mejor opción: alquilar las instalaciones (D) Mientras mayor sea la cantidad de hectáreas en producción, el proyecto será más estable ante las variaciones de precios de venta y costo de insumos ya que es la venta que produce mayor ganancia.

GRACIAS