VIGILANCIA DEL VIRUS DENGUE EN EL PERÚ Blgo. Enrique Mamani Zapana Laboratorio de Metaxénicas Virales INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

EL VIRUS Familia: Flaviviridae. Causa el Dengue y Dengue Hemorrágico. Transmitido por mosquitos. Es un virus ARN (Ácido Ribonucleico de una sola hebra). Tiene 4 serotipos: (DENV-1, 2, 3 y 4).

VIRUS DENGUE PrM :Glicoproteína C y RNA: Precursor de M Protege a la proteína E M: Induce Acs. Nt y protección C y RNA: 11Kd Nucleocapside Epitopes céls T E: Principal Proteína Estructural (53-54kd) Glicoproteína

Aedes aegypti

Diagnóstico Dengue Aislamiento Viral Detección Antígeno IgM IgG>1280 Seroconversion Diagnóstico Dengue Detección Antígeno Detección Genoma Situación Epidemiológica CLINICA

DINAMICA DE RESPUESTA INMUNE

ASPECTOS IMPORTANTES EN EL DIGNOSTICO Ficha Clínica Tipo de muestra Obtención de muestras Transporte y conservación de M. Tipo de prueba 13

CRITERIOS PARA LA OBTENCION, CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS DE ACUERDO AL TIPO DE PRUEBA Método de Diagnóstico Obtención de muestras Muestra Biológica Cantidad Conservación y Transporte Tiempo de resultado en el Sistema NETLAB Anticuerpos: IgM, IgG Sangre.- A pacientes con tiempo de enfermedad igual o mayor a 6 días. Suero 2 ml Estéril. Enviar en cadena de frío 2 – 8 °C 3 días. Detección del antígeno Ag NS1, detección de ARN, aislamiento viral y tipificación de los serotipos. Sangre.- A pacientes con un tiempo de enfermedad igual o menor a 5 días. (período virémico) 2 ml. 6 días para PCR y hasta 30 días para aislamiento viral. Tejido.- Realizar la necropsia dentro las 24 horas de fallecimiento (Tejido bazo, hígado y/o riñón). Tejido ± 2 cm3 Estéril. Enviar en preservante y en cadena de frío 2 – 8 °C Histopatología e inmunohistoquímica. Tejido.- Realizar la necropsia dentro de las 24 horas de fallecimiento (Tejido bazo, hígado y/o riñón). ± 2cm3 Enviar en formol al 10% tamponado, en un volumen 10 veces del volumen de la muestra, a temperatura ambiente. 5 días.

KIT ELISA DE CAPTURA IgM DENGUE IMPLEMENTACION: 2008 -2010 TRANSFERENCIA: 2010 lotes pilotos SENSIBILIDAD % ESPECIFICIDAD% PRUEBA DIAGNOSTICA TARIKI IGM DENGUE – INS 99.3 98 + - 1 100 101 Total 150 102 255 PRUEBA DE REFERENCIA 154 TARIKI IGM DENGUE INS 149 2

ELISA CAPTURA IgM o IgG DENGUE ELISA CAPTURA IgM: Infección reciente. ELISA CAPTURA IgG: Infección secundaria ELISA INDIRECTA IgG: Infección pasada 14

IgM Días Fiebre % IgM 6-10 días.......... 96% Sensibilidad 98% Especificidad Días Fiebre % IgM 1-5 56 6-10 96 20-30 93 40-60 23 Costa Rica, Panamá Nicaragua Guzmán et al., 97

PRUEBAS RAPIDAS IgM, IgG Y ANTIGENO.

PRUEBAS RAPIDAS ANTIGENO NS1, IgM, IgG Prueba diagnóstica AgNS1 AgNS1 + IgM/IgG Estándar Diagnostic, INC® Sensibilidad 40.6% (31.7-49.5) 73.4% (65.4-81.5) Especificidad 95.1% (89.8-100) 91.5% (84.8-98.1) Pan Bio® 42.1% (31.7-49.5) 74.2% (66.1-82.3) 79.2% (69.9-88.6) Evaluación de pruebas rápidas de detección NS1Ag, IgM e IgG

PRUEBA ELISA ANTIGENO NS1 Detecta antígeno NS1 Suero de 1-5 días Diagnostico temprano de dengue. Sensibilidad 93% Especificidad 100% Sensibilidad(97.3%) en inf. aguda primaria Sensibilidad (70.0%) en inf. aguda segundaria VPP 100% VPN 97.3%. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection V. Kumarasamya, A.H. Abdul Wahaba, S.K. Chuab, Z. Hassana, Y.K. Chema, M. Mohamada and K.B. Chua Journal of Virological Methods Volume 140, Issues 1-2, March 2007, Pages 75-79

Aislamiento del virus Dengue Inmunofluorescencia Indirecta Acs. Monoclonales específicos tipo

AISLAMIENTO VIRAL Células cultivo C6-36 LINEA C6-36 NORMAL LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO

Diagnóstico Inmunohistoquímico en muestras fallecidos FHD/SCD Necrosis Focal Células Kupffer

RT- PCR Diagnóstico Vigilancia Epidemiología Molecular Estudios etiopatogenia Vacunas

RT-PCR EN DENGUE RT PCR Dengue Multiplex Sensibilidad: 98% Especificidad: 98%

Cuantifica carga viral PCR EN TIEMPO REAL Detecta Cuantifica carga viral

ANALISIS GENETICO DEL DENV-1.- Las secuencias que obtuvimos se agrupan con el genotipo América-África, siendo el primer serotipo que reingreso al Perú en 1,990 Se mantiene la circulación del mismo genotipo desde su ingreso en el año 1,990. Aunque se han establecidos clados distintos que tienen correlación con el tiempo y espacio, se puede observar para el 2,007 la circulación de dos clados dispersos que abarca la zona norte de Perú y la zona central del país, respectivamente.

Árbol filogenético de secuencias para DENV-1 obtenidos mediante NJ con 500 repeticiones de la región E/NS1 considerando las secuencias reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

ANALISIS GENETICO DEL DENV-2.- Las secuencias que obtuvimos hasta el presente corresponden a los genotipos América que ingresó a Perú en 1,995 y al genotipo América-Asia que ingreso en el 2,001. Se evidencia la relación del genotipo América Asia con la presencia de dengue hemorrágico.

Arbol filogenético de secuencias DEN2 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

ANALISIS GENETICO DENV-3.- Se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-3 genotipo INDIA. Se observa que desde su ingreso a Perú, este genotipo presenta alta dispersión, formando clados que se agrupan según los años y área geográfica, respectivamente. La presencia de este genotipo ha sido permanente a la fecha y esta relacionado con casos de dengue grave.

Árbol filogenético de secuencias DENV-3 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura - Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

ANALISIS GENETICO DENV-4.- Para el análisis también se consideraron secuencias reportadas al GENBANK por diferentes países a fin de establecer la distribución filogenética descritos por Rico-Hesse et. al. También se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-4 genotipo INDONESIA.

Árbol filogenético de secuencias DENV4 de la región E/NS1 obtenidas mediante NJ, modelo Tamura - Nei con 500 repeticiones, considerando secuencias previamente reportadas en el GEN BANK y las obtenidas en el presente estudio.

CIRCULACION DE UN NUEVO LINAJE DEL VIRUS DENGUE 2 GENOTIPO AMERICA / ASIA EN LA REGION AMAZONICA DE PERÚ, 2010 Mamani E.1, Alvarez C. 2, García M. 1, Figueroa D.1, Gatty M.2, Guio H.3, Merino S.1, Valencia P. Calampa C. 2 , Franco L 4, Cabezas C.1 1 Laboratorio de Arbovirus – Instituto Nacional de Salud, Perú 2 Dirección Regional de Salud Loreto. 3 Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología – Instituto Nacional de Salud 4 Instituto Carlos III – España. Email: emamani@ins.gob.pe

Árbol filogenético de secuencias genéticas de la región E/NS1 del DENV-2 La secuencias corresponden a los años: 1995- 2001, 2001, y 2010. Mamani E et al. Circulación de un nuevo linaje del virus dengue 2 genotipo América/Asia en la Región Amazónica del Perú, 2010

Distribución del Serotipos de dengue Tipo 2 Perú 2011* SE 11 Fuente: INS hasta el 17/03/01

INTERPRETACION DE RESULTADOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE DENGUE a. CASO CONFIRMADO Resultado Positivo por RT-PCR. Resultado Positivo de aislamiento viral. Resultado Positivo a antígeno NS1. Resultado Positivo de IgM en una sola muestra Evidencia de seroconversión en IgG en muestras pareadas.

DIRECTIVA SANITARIA PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE DENGUE La implementación de la nueva directiva de diagnóstico de laboratorio. -Vigilancia rutinaria -Vigilancia centinela en establecimientos -Detección temprana de brotes (30 a 50 muestras)

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Laboratorio de Microbiología y Biomedicina Chorrillos, Lima

Centro de Investigación de Enfermedades Tropicales ¨Maxime Kuczynski¨, Iquitos-Loreto 44

CONTRIBUCION DEL LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO DE DENGUE Manejo clínico del paciente (Hto. Plaq. y otros). Confirmación de casos de dengue (serológicas virológicas y moleculares) Demostrar y predecir severidad (carga viral en estudio) Detección temprana circulación virus dengue en áreas nuevas (vigilancia basada en Lab.) Detección temprana de nuevos serotipos y subtipos (vigilancia basada en Lab.) 45

CONTRIBUCION DEL LABORATORIO EN EL DIAGNOSTICO DE DENGUE Estimado de incidencia después de epidemias Confirmación casos y su caracterización (severos) Caracterización cepas dengue (secuenciamiento) Diseño de nuevas estrategias o herramientas de diagnóstico. Diferenciar enfermedades similares (diagnóstico diferencial) 46

GRACIAS