TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO Cuantificación del número de moléculas por célula Determinación de moléculas solubles Enumeración celular Nuevas formas de marcaje 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcaje intracelular 4.3 Marcaje de proteínas totales

1) CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE MOLÉCULAS POR CÉLULA INDIVIDUAL

Cuantificación del número de moléculas por célula individual Cuantificación del número medio de moléculas por célula La cantidad de antígeno que contiene cada célula se expresa en ABC (antigen binding capacity) o capacidad de unión antigénica

CUANTIFICACIÓN DE ABC 1.1) QUIFIKIT 1.2) RAINBOW BEADS

1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas. Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)

PROTOCOLO DE MARCAJE

PROTOCOLO DE MARCAJE

QUIFIKIT

QUIFIKIT

REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media

RECTA DE REGRESIÓN fluorescence intensity) log MFI (mean log ABC (antigenic binding capacity) 3 4 5 6 fluorescence intensity) log MFI (mean 1 2 voltage 453 (r2=0.999) voltage 463 (r2=0.999) voltage 473 (r2=1) voltage 483 (r2=0.999) voltage 493 (r2=0.999)

1.2) RAINBOW BEADS Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente

RAINBOW BEADS Patrón Problema

RAINBOW BEADS

CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno Problema: emite fluorescencia inespecífica Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo

CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo

DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA En linfocitos CD4 activados disminuye la intensidad de expresión del correceptor CD4. En linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del correceptor CD8 Activación TCR modulación de CD3 La apoptosis reduce la expresión de determinados antígenos de linaje

2) CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES

FUNDAMENTO El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

PROTOCOLO Incubación Lavado Marcaje Lavado

DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES - + SSC Citocina - +

CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS SOLUBLES Más rápido y sensible que el ELISA. 90 min. Sensibilidad fentomolar: 10-15 M Multiparamétrico

3) ENUMERACIÓN CELULAR

ENUMERACIÓN CELULAR Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando - Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente

CULTIVOS CELULARES Células PHA Medio

ENUMERACIÓN CELULAR R1 Crecimiento R2 Basal R1 R1 Muerte R2 R2 celular Tras cultivo CÉLULAS T CÉLULAS B MICROPARTÍCULAS R1 Crecimiento R2 Basal R1 R1 Muerte celular R2 R2

ENUMERACIÓN CELULAR Crecimiento Tras Cultivo Apoptosis

CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS N0 = concentración celular inicial Nt = concentración celular a tiempo t Nt = (Ratiot / Ratio0) * N0 Ratiot = (Célst / Partículast) Ratio0 = (Céls0 / Partículas0)  t. Partículas = cte. Nt = (Célst / Céls0) * N0

ENUMERACIÓN CELULAR Basal 4000 2000 = 2 Crecimiento 1 50.000 céls 2 x = 2 Crecimiento 1 50.000 céls 2 x = x = 100.000 céls Apoptosis 1000 2000 = 0.5 Células 2000 Partículas 2000 = = 1 1 50.000 céls 0.5 x = 2000 = 50.000 céls x = 25.000 céls

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR Centrifugación Sedimentación de células y micropartículas Número de células y de micropartículas adquiridas

CENTRIFUGACIÓN CELULAR Número de lavados 1 2 3 % de recuperación celular 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 300 g 200 g

SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS Ratio Céls/Micropartículas 0.0 .2 .4 .6 .8 1.Adquiridas inmediatamente Tras 20 minutos: 2. Adquirir 3. Agitación manual. 4. Vortex *

NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS Ratio células/partículas 0.1 1 10 2 4 6 8 12 14 100 CV del ratio

VALIDACIÓN DEL MÉTODO Precisión Sensibilidad Exactitud Coeficiente de variación (CV) Sensibilidad Límite de sensibilidad Exactitud Linealidad

ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD Contadores celulares Células/ml x 10-3 1 10 100 1000 CV (%) 20 30 40 50 60 Microscopía Citometría de flujo

ESTUDIO DE LA EXACTITUD Microscopía Contadores celulares Citometría De flujo Ratio céls/micropart 2 4 6 8 10 200 400 600 800 1000 r= 0.9997 Nº absoluto de células x 10-3 Nº medio de células por campo 10 20 30 40 50 60 70 r = 0.9956 Nº medio de células x 10-3 200 400 600 800 1000 r= 0.9891

ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.

FRAGMENTACIÓN CELULAR Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos. ¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?

Permeabilidad de membrana FRAGMENTACIÓN CELULAR Permeabilidad de membrana Tamaño celular Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis.

INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS Prevalencia = apoptóticas /viables+apoptóticas = (1/5) 20% = prevalencia de la apoptosis Incidencia = (apoptóticas + fragmentadas+ pérdidaAg) / total = (6/10) 60% = incidencia de la apoptosis

INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS (1/10) = 10 % prevalencia Incidencia = (1/10) 10%

APOPTOSIS TEMPRANA (4/9) = 44% prevalencia Incidencia (5/10) = 50%

APOPTOSIS TARDÍA Fragmentación celular Incidencia = 60% (1/5) = 20 % prevalencia Fragmentación celular Cuerpos apoptóticos

IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS 0 hours 6 hours 24 hours

PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL) Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original

APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA CD3 CD8 CD4 CD19 20 40 60 80 100 AI TOTAL AI HIGH AI MED AI LOW Porcentaje de células apoptóticas ALL BRIGHT DIM NEG AEL

CD19 on B-CLL leukemic cells Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosis CD19 on B-CLL leukemic cells Apoptóticas tardías MFI 004 Apoptóticas intermedias MFI 015 Apotóticas tempranas MFI 061 MFI 131 Células viables

MFI PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19) POR CÉLULA INDIVIDUAL Viable cells Early Apoptotic Intermediate Late MFI 20 40 60 80 100 120 140 ESTADIO DE LA APOPTOSIS

PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD8 Y CD56) POR CÉLULA INDIVIDUAL

PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD3 Y CD5) POR CÉLULA INDIVIDUAL

PORCENTAJE DE PÉRDIDA DE AEL ENTRE LAS CÉLULAS VIABLES Y LAS APOPTÓTICAS TEMPRANAS (EA)

REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS ___________________________________________________________ VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS ≤ APOPTÓTICAS _________________________________ AI = VIABLES + APOPTÓTICAS

APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS VIABLES + APOPTÓTICAS VIABLES + APOPTÓTICAS ≤ 2 2 + 1 + 3 = 0.25 < = 0.5 6 + 2 6 + 2+ 1 + 3

Subpoblación linfocitaria % de células apoptóticas AR vs. AI Subpoblación linfocitaria CD19 CD56 CD8 CD4 CD3 % de células apoptóticas 20 40 60 80 100 AI AR

4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE

4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE 4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes 4.2 Marcajes intracelulares 4.3 Marcajes de proteínas totales

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Estudio de receptores con ligandos solubles (citocinas, factores de crecimiento). Para medir la capacidad de unión de ligando por célula individual. Se emplean ligandos marcados con moléculas fluorescentes Buffer de marcaje especiales optimas para unión del ligando a su receptor específico

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Ligando Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque pH, PBS sin suero.

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Dominio de unión Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque osmótico, PBS sin suero.

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES Ligando-FITC Unión inespecífica Receptores unidos a ligando frío no son reconocidos marcaje en ausencia de ligando frío. Choque osmótico, PBS sin suero.

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES Mitocondriales (Bcl-2, Apo-2) de gránulos de secreción (citocinas, perforinas, granzimas) Detección de receptores presentes en citoplasma pero no expresados en superficie Caracterización multiparamétrica de las células que producen las citocinas en poblaciones de células mononucleares

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES Permite el estudio de gran número de células y realizar medidas estadísticamente significativas: 10 → error = 33% 100 → error = 10% 10.000 → error=1% Aporta información sobre producción de citocinas por células individuales caracterizadas por inmunofenotipo

LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE MARCAJE INTRACELULAR Sensibilidad limitada: cantidad mínima de citocina detectable en cada célula frecuencia mínima de células positivas discriminable del fondo Para marcar intracelularmente hay que matar las células

SENSIBILIDAD

SOLUCIONES CANTIDAD MÍNIMA DE CITOCINA DETECTABLE EN CADA CÉLULA Anticuerpos marcados con APC para aumentar la intensidad de fluorescencia media por célula Aumentar el número de fluorocromos por anticuerpo Inhibidores del transporte celular para aumentar las concentraciones intracelulares

FRECUENCIA DE CÉLULAS POSITIVAS DISCRIMINABLES +S, -E -S, +E El segundo problema no tiene fácil solución podemos elevar los umbrales de positividad para aumentar la especificidad pero perdemos sensibilidad para detectar células positivas.

AMPLIFICACIÓN ENZIMÁTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR Se marcan las células con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) La HRP produce radicales inestables tiramina conjugados con biotina que se depositan alrededor del lugar de catálisis La adición de estreptavidina conjugada con HPR amplifica la señal Se incrementa 15 veces la relación señal-ruido

AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD) HPR Biotina + Sustrato Radical tiramina Tiramina

AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD) Estreptavidina-HPR +

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL-10 e IFNg se expresan en membrana plasmática en un número bajo de copias (<300 copias/membrana) Sistemas de amplificación Liposomas magneto-fluorescentes 1 x 105 IL-10 2.3 34.8 IFNg 12.5 12.5

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL-10 2.3 34.8 IFN 12.5 12.5

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS IL-10 2.3 34.8 IFN 12.5 12.5

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales Se pueden fabricar también con fragmentos Fab

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CD45 Anti-citocina Citocina

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones

4.3) MARCAJE DE PROTEÍNAS TOTALES

RELACIÓN ENTRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y LA APOPTOSIS Todas se dividen una vez 1 cél. apoptosis 1 se divide 3 veces Sembramos 20000 células recogemos 80000 ¿cuantas veces se han dividido?¿Como saber que células y cuanto han crecido? Ej. Superantígenos. ¿Cómo conocer la frecuencia de células respondedoras a un determinado antígeno? Proliferación ½ apoptosis ½ se dividen 2 veces

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE) Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares y que se reparte por igual entre las células hijas

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE Fluorescencia / célula X X / 2 X / 4

MARCAJE CON CFSE Después Basal del cultivo But this will be the topic of another talk

CULTIVOS CELULARES Células PHA Medio

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE No proliferantes Proliferantes

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE Combinación con antígenos de superficie: relación procesos de diferenciación con procesos de proliferación

3 días de cultivo 3% 59% PHA 38% 3% 53% PHA + IL-2 44%

5 días de cultivo 23% 48% PHA 29% 15% 48% PHA + IL-2 37%

7 días de cultivo 71% 19% PHA 10% PHA + IL-2 37% 40% 23%

MARCAJE CON CFSE Estudios in vivo Estudios ex vivo Estudios in vitro