La espectroscopia estudia la absorción y emisión de la radiación electromagnética por la materia. La radiación electromagnética tiene carácter ondulatorio y esta formada por fotones, cuya energía viene dada por: E = h = hc / = c Siendo h, la constante de Planck, ν, la frecuencia y λ, la longitud de onda. La energía de la radiación viene determinada por su frecuencia o longitud de onda: rayos cósmicos, rayos gamma, rayos X, radiación ultravioleta‐visible, radiación infrarroja, microondas,..

Los átomos y moléculas, sólo absorben y emiten radiación de determinadas frecuencias, lo que implica la cuantización de sus niveles de energía. La separación entre los niveles electrónicos de una molécula se encuentran entre el IR cercano y el Visible‐Ultravioleta.

 La espectroscopia ultravioleta-visible estudia la absorción de radiación ultravioleta–visible por una molécula.  Al hacer incidir radiación UV‐Visible de energía adecuada, las moléculas pasan del estado fundamental de menor energía a un estado de mayor energía (excitado).  Si la energía de la radiación coincide con la diferencia de energía entre el último estado ocupado (fundamental) y el primer estado vacío (primer estado excitado) se produce la transición de un electrón a un estado de energía superior.

Si E (fotón) = ΔE (molécula) = E 2 – E 1 La luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia y éstos son promovidos a estados excitados (de energía mayor). Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia adecuada, ocurre una transición desde el estado fundamental a un estado excitado.. Algunas moléculas, como es el caso del β‐caroteno, naranja de metilo, fenofltaleína, ……., absorben energía en el visible así como en el UV, lo que produce que tengan color (visible). Esta moléculas se suelen caracterizar, por tener un sistema de enlaces .

La longitud de onda a la que absorben determina el color. La porción de la radiación UV-visible que es absorbida implica que una porción de radiación electromagnética no es absorbida por la muestra y que por tanto es transmitida a través de ella y puede ser captada por el ojo humano. Es el color de la sustancia.

 En la siguiente tabla, la columna del "color" indica la porción del espectro que es absorbida, mientras que la correspondiente al "color complementario” indica la porción de radiación electromagnética que no absorbe la muestra y que por tanto es transmitida a través de ella y puede ser captada por el ojo humano (color de la disolución).  λ (nm) Color Color Complementario  380‐435 Violeta Verde‐amarillo  435‐480 Azul Amarillo  480‐490 Azul‐verdoso Anaranjado  490‐500 Verde‐azulado Rojo  500‐560 Verde Púrpura  560‐580 Verde‐amarillo Violeta  580‐595 Rojo Azul  595‐650 Anaranjado Azul‐verdoso  650‐780 Rojo Verde‐azulado

 Espectrofotometría de absorción molecular Técnica cuantitativa que permite relacionar la cantidad de una sustancia con la cantidad de luz absorbida.  Ley de Lambert-Beer La cantidad de luz absorbida depende de: La energía de la radiación (Intensidad) y la frecuencia de la radiación utilizada. La naturaleza de la muestra. El número de moléculas sobre el que incide la radiación.

 La Ley Lambert Beer es un medio matemático de expresar cómo la materia absorbe la luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres fenómenos físicos:  La cantidad de material de absorción en su trayectoria (concentración)  La distancia que la luz debe atravesar a través de la muestra (distancia de la trayectoria óptica)  La probabilidad de que el fotón de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el material (absorbencia o coeficiente de extinción) Esta relación puede ser expresada como: A=  b C

 La ley de absorción “Ley de Lambert-Beer”, indica cuantitativamente la forma en que el grado de atenuación depende de la concentración de las moléculas absorbentes y de la longitud del trayecto en el que ocurre la absorción. Cuando la luz atraviesa un medio que contiene un analito absorbente, disminuye su intensidad como consecuencia de la excitación del analito. Cuanto más largo sea el medio por el que pasa la luz existirán más moléculas o átomos absorbentes y mayor será la atenuación. Además a mayor concentración de los átomos o moléculas absorbentes, mayor atenuación.

 Transmitancia “T” de una solución es la fracción de radiación incidente que se transmite en la solución. T = P/P 0  Porcentaje de transmitancia: si T = P /P 0 % T = (P/P 0 ) X 100 %  Absorbancia “A” de una solución se relaciona con la transmitancia de manera logarítmica. La transmitancia se reduce a medida que aumenta la absorbancia:  T = P /P 0 y A = -log(P/P 0 ) o A = -log T  si T = 0 => A=∞  T = 1 => A=0

 Ley de Lambert-Beer (relación empírica)

 Medición de la transmitancia y absorbancia Normalmente, la transmitancia y la absorbancia, no son susceptibles de ser medidas tal cual lo indican las ecuaciones, ya que la solución que se estudia debe mantenerse en una celda o cubeta. De esta manera, es posible que se produzcan pérdidas importantes por reflexión y dispersión, a través de las paredes de la celda. La luz también puede dispersarse en todas direcciones desde la superficie de las moléculas o partículas grandes (como el polvo) en el disolvente y causar la atenuación adicional del haz a su paso por la solución.

 Medición de la transmitancia y absorbancia La compensación de estos efectos requiere comparar la energía de un haz que se transmite por una celda que contiene la solución del analito con la energía de un haz que cruce una celda idéntica que sólo contiene el disolvente o un blanco. Así, se obtiene una absorbancia experimental, que se aproxima mucho a la absorbancia verdadera de la solución: A = log (P 0 / P) ≈ log (P solvente / P solución) Nota: Los términos P 0 y P en lo sucesivo se usaran para referirse a la energía de un haz que ha cruzado celdas que contienen el blanco (solvente) y el analito.

 Aspectos cuantitativos de la absorción de la radiación: Ley de Lambert y Beer  La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente c y a la longitud de trayecto b del medio de absorción:  A = log (P 0 / P)= abc Donde a es la absortividad (constante de proporcionalidad). Dado que la absorbancia es una cantidad adimensional, la absortividad debe tener unidades que eliminen las de b y c. Por ej. c = [g L -1 ] y b = [cm], será a = [L g -1 cm -1 ].  Cuando la concentración se expresa en moles por litro, y b en cm, la cte. se llama absortividad molar “Ɛ”: A = Ɛ.b.c Ɛ = [L mol - 1 cm -1 ]

 Aspectos cuantitativos de la absorción de la radiación: ley de Lambert y Beer  La absortividad de una especie en el punto máximo de absorción es característica de la especie. La absortividad máxima de muchos compuestos orgánicos varía desde 10, o menos, hasta , o más. Algunos complejos metálicos de transición tienen absortividad molar de hasta Este valor proporciona una mayor sensibilidad analítica.

 Aplicaciones de la ley de Lambert- Beer Cálculo de la absortividad molar de especies conociendo la concentración y la longitud del trayecto. Se aplica a soluciones que contienen dos o más tipos de sustancias absorbentes. Siempre y cuando no haya interacción de las diversas especies, la absorbancia total de un sistema de componentes múltiples a una sola longitud de onda es la suma de las absorbancias de todos ellos:  A total = A 1 + A 2 + …. + A n = Ɛ 1 bc 1 + Ɛ 2 bc 2 +….+ Ɛ n bc n

 Limitaciones de La Ley de Lambert y Beer Desviaciones reales, respecto a la proporcionalidad directa entre la absorbancia y concentración, cuando la longitud de trayecto b es una constante. Desviaciones químicas, que resultan de cambios químicos ocurridos al modificarse la concentración. Desviaciones instrumentales, que resultan del método utilizado para medir la absorbancia.

 Desviaciones reales  La ley de Lambert- Beer describe el comportamiento de absorción sólo en soluciones diluidas, en ese sentido es una ley límite. En concentraciones superiores a 0,01 M, la distancia promedio entre los iones o moléculas de la especie absorbente disminuye hasta que cada partícula afecta a la distribución y a la magnitud de la absorción, de las partículas vecinas. La magnitud de la interacción depende de la concentración, por lo que la aparición de este fenómeno causa desviaciones en la relación lineal de la absorbancia con la concentración. En ocasiones ocurre un efecto similar en soluciones diluidas de absorbentes que tienen concentraciones muy altas de otras especies, en particular de electrolitos. Cuando los iones están muy cerca unos de otros, la absortividad molar del analito puede alterarse debido a las interacciones electrostáticas, lo que da lugar a desviaciones respecto a la ley de Lambert- Beer.

 Desviaciones químicas  Aparecen desviaciones respecto a la ley de Lambert- Beer cuando la especie absorbente experimenta asociación, disociación o reacción con el disolvente y se generan productos cuya absorción es diferente a la del analito. La magnitud de tales desviaciones puede predecirse a partir de la absortividad molar de las especies absorbentes y de las constantes de equilibrio de las reacciones.  Los equilibrios característicos que originan este efecto abarcan los equilibrios monómero-dimero, de complejación metálica con más de un tipo de complejo, los equilibrios ácido-base y de asociación disolvente- analito.

 Desviaciones instrumentales: luz policromática  La ley de Lambert-Beer se aplica en sentido estricto sólo cuando se realizan medidas de radiación monocromática. En la práctica se utilizan las fuentes policromáticas*, con distribución continua de longitudes de onda, junto con una rendija o filtro para aislar una banda casi simétrica de longitudes de onda en torno a la longitud que se requiere. *Luz policromática: el haz de luz consta de muchas longitudes de onda. La luz monocromática se obtiene por filtración o refracción de la luz policromática.

 Efecto de la luz policromática en la ley de Lambert-Beer Considerando un haz de radiación que conste de dos longitudes de onda λ’ y λ’’:  A = log (P 0 / P) = Ɛ’ bc Donde: P 0 = energía incidente; P= energía resultante; b= longitud del trayecto c = concentración del absorbente; Ɛ’ = absortividad molar Cuando se realizan medidas de absorbancia con una radiación que consta de ambas longitudes de onda, la energía del haz emergente de la solución es la suma de la energía emergente para las dos longitudes de onda, P’ + P’’. De igual manera, la energía incidente total es la suma P 0 ’ + P 0 ’’ y la absorbancia medida Am es Am = log (P 0 ’ + P 0 ’’/ P’ + P’’) Si P 0 ’/ P’=10 Ɛ’ bc => P’= P 0 ’10 -Ɛ’ bc y P 0 ’’/ P’’=10 Ɛ’’ bc => P’’= P 0 ’’10 -Ɛ’’ bc Am = log (P 0 ’ + P 0 ’’/ (P 0 ’10 -Ɛ’ bc + P 0 ’’10 -Ɛ’’ bc ))

 Efecto de la luz policromática en la ley de Lambert-Beer Y se cumple la ley de Lambert- Beer. Sin embargo cuando las absortividades molares son muy diferentes, la relación de Am, con la concentración ya no es lineal. La desviación respecto de la linealidad aumenta conforme lo hace la diferencia entre Ɛ’ y Ɛ’’. Esta derivación puede ampliarse para incluir longitudes de onda adicionales, con las que el efecto permanece sin cambio. Las desviaciones de la ley de Lambert-Beer son mínimas cuando la banda de longitudes de onda seleccionadas para las medidas espectrofotométricas corresponde a una región del espectro de absorción en la cual la absortividad molar del analito sea prácticamente constante. Sin embargo, muchas bandas moleculares en la región UV/Visibles y en el infrarrojo son muy pronunciadas. Para evitar desviaciones es aconsejable elegir una banda de longitud cercana a la longitud de onda de máxima absorción, donde la absortividad del analito varía poco con la longitud de onda.

 Efecto de la luz policromática en la ley de Lambert-Beer En el espectro de absorción izquierdo, la absorbancia del analito es casi constante en la banda A con la variación de la longitud de onda de la fuente de radiación mientras que la banda B coincide con una región donde cambia la absorbancia del analito. En el gráfico de la derecha, el uso de la banda A, permite obtener una relación lineal, pero hay una considerable variación de la ley de Beer en el uso de la banda B.

 Desviaciones instrumentales: luz parasita La radiación parasita, es la radiación debida al instrumento y está fuera de la banda de longitudes de onda seleccionada para la medida. Esta radiación parasita proviene de la dispersión y reflexión de la superficie de las rejillas, lentes o espejos, filtros y ventanas del equipo de medición. Cuando se realizan medidas en presencia de luz parasita, la absorbancia observada viene dada por: A’ = log (P 0 + P s / P + P s ) Donde P s es la energía radiante de la luz parasita. La luz parasita hace que la absorbancia aparente sea menor que la absorbancia real. Las desviaciones resultantes de la luz parasita son más significativas para valores de absorbancia altos. Los niveles de radiación parasita pueden ser de hasta 0,5 % en instrumentos modernos, por lo que pocas veces se miden valores de absorbancia mayores a 2, a menos que se tomen las precauciones especiales o se usen instrumentos especiales, con niveles muy bajos de luz parasita. Algunos instrumentos de filtro de bajo costo pueden tener desviaciones de la ley de Beer con absorbancia de 1,0, debido a los niveles de luz parasita o a la presencia de luz policromática.