Métodos de enumeración indirectos: DNA y Proteínas

Métodos de enumeración: Conteos directos Microscopia Todos los microorganismos Ventajas No cultivo Desventajas Que es una célula Vivos vs Muertos Separación de células Interferencia Sensitividad

Conteos directos: cámara Petroff-Hauser Figure: 06-09 Caption: Direct microscopic counting procedure using the Petroff-Hausser counting chamber.

Área de conteo http://www.hausserscientific.com/ The number of cells per milliliter (ml) = Number of cells counted X dilution (if used) X 50,000**50,000 = 50 (cell depth is 1/50) X 1000 (1000 cubic mm = 1 milliliter)

Enumeracion en el Microscopio Conteos directos Tinción Filtración Fijación Usualmente dos ordenes de magnitud mayor que los viables Dilución Fijación Tinción Lavados Muestra Enumeracion en el Microscopio

Tintes fluorescentes DNA - Proteínas 4,6 diamindino-2-phenylindole (DAPI) Acridinina anaranjada (AO) AODC Proteínas 5-[4,6-dichlorotriazin-2-yl] aminofluoresceins (DTAF)

Tintes DAPI AO

Conteos directos cont. Pueden ser selectivos Vivos / Muertos Anticuerpos monoclonales Tinciones filogenticas Fluorescent in-situ hybridization (FISH)

Epifluorescence Microscopy

Métodos indirectos No requieren crecimiento Macromoléculas como indicadores Conversión Fosfolipidos ATP LPS -- Gram + Ácidos teicoicos -- Gram -

Lípidos Lípidos Fatty acid methyl esther (FAME) Patrones Saturaciones y numero de Carbono Masa Fatty acid methyl esther (FAME) Phospholipid-linked fatty acid (PLFA) Existen 6 clases de lipidos que contienen sobre seis variaciones Los factores de distincion son Las concentraciones o cantidades pueden ser medidas utilizando los estandards apropiados PLFA es indicativo de biomasa viva porque de lo contrario se degrada a un FA no polar neutral 100 umol PLFA= 2.5 x 1012 celulas aver vol .48 um3

PLFA

FAME

Enumeración de Gram negativos

Enumeración de Gram positivos

Componentes estructurales Contenido mureina -> producción de lactato a partir de Acido murámico. G+ 44 µg MA/mg C G- 12 µg MA/mg C Razon G+/G- necesaria Gram negativos LAL -- 10 cells/ml Gram positivos Ácidos teicoicos Hongos quitina Hongos interferencia por artropodos

Biomasa: Pigmentos fotosinteticos Biomasa organismos fotosinteticos Chl a -> Algas y Cianos 664nm Bchl -> foto. Anoxigenicos > 750 nm Facil de extraer

Extracción de ácidos nucleicos

Resumido Rompimiento de células (1-5) Purificación (6-10) Concentrar células Solución de Lisis (Detergente) Congelar / Calentar Purificación (6-10) Remoción de RNA Remoción de Proteínas

Resumido cont. Precipitación del DNA (11-16) Isopropanol y Frío Centrifugaciones Lavados Secado y resuspensión (17-18)

Cuantificación de Proteínas Ensayo de Biuret Principio Condiciones alcalinas Dos o más enlaces peptídicos Sales de cobre rx. con enlaces peptídico formando un complejo color violeta Leer absorbancia a 540 nm